Delaying neurodegeneration through caloric restriction approaches: From mechanisms to molecular therapy

Abstract

Machado-Joseph disease (MJD), also known as spinocerebellar ataxia type 3 (SCA3), is a fatal autosomal dominant neurodegenerative disease. MJD is caused by the CAG trinucleotide expansion in the C-terminal coding region of the ATXN3 gene, at chromosomal locus 14q32.1. The wild-type ATXN3 gene presents from 12 to 44 CAG repeats and the mutant ATXN3 gene presents from 55 to 86 CAG, in the 10th exon. The polyglutamine (polyQ)-expanded mutant ataxin-3 can interact with several proteins, and accumulates in the form of aggregates in the brain, particularly in the nucleus of neurons. The main affected brain areas are the cerebellum, brainstem, and basal ganglia, particularly substantia nigra and striatum. MJD is the most common dominantly inherited ataxia worldwide, and is a late-onset disease that manifests with cerebellar ataxia, rigidity, and distal muscle atrophies. Unfortunately, there is no therapy to cure or even to retard the progression of this disease. Caloric restriction (CR) is the oldest and the most reliable experimental manipulation that is known to extend the lifespan in several species. Additionally, it has been shown that CR is neuroprotective. There are several mechanisms underlying CR beneficial effects. One of the more important mechanisms is the effect of CR on the levels and activity of sirtuins. Sirtuins are NAD+-dependent deacetylases, existing seven sirtuins in mammals (SIRT1-7). SIRT1, the most studied sirtuin so far, mediates CR effects, since CR is able to increase SIRT1 activity and levels. In this work we aimed at unravelling the potential beneficial effects of CR in MJD and the role of SIRT1 in these effects, and also to investigate the mechanisms underlying mitochondrial dysregulation associated with MJD pathogenesis. For this we used cellular and mouse models of MJD. This thesis is organized in five chapters. In Chapter 1 is provided a review of the main literature regarding MJD, CR, and sirtuins, with a focus on SIRT1. In Chapter 2 we evaluate the role of CR in two different and complementary mouse models of MJD, and we study the contribution of SIRT1 for these effects. We show that CR robustly ameliorates motor deficits and the associated neuropathology of MJD. Moreover, we also observe that SIRT1 is particularly involved in these outcomes, since its knockdown abolishes the beneficial effects of CR. In addition, the specific and localized SIRT1 overexpression ameliorates MJD neuropathology. We also provide data demonstrating that SIRT1 is able to activate autophagy, leading to the clearance of toxic species of mutant ataxin-3, and is also able to reduce neuroinflammation associated with MJD. In Chapter 3 we investigate the crosstalk between the nucleus and mitochondria in MJD experimental models. Our data suggest that the alteration of the nuclear-mitochondrial communication, generated by a severe decrease in NAD+, is connected to the mitochondrial dysfunction. Moreover, we elucidate that this decrease in NAD+ probably results from the increase in the consumption of NAD+, due to an increase in cluster of differentiation 38 (CD38), and a malfunction of the NAD+-salvage pathway, associated with a decrease in nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase 1 (NMNAT1). Likewise, our data also demonstrate that the lentiviral overexpression of NMNAT1 is able to reestablish nuclear-mitochondrial communication, and consequently mitochondrial respiration. In Chapter 4 we evaluate the potential beneficial effects resulting from the pharmacological increase of NAD+ (with nicotinamide mononucleotide - NMN) or the pharmacological activation of SIRT1 (with resveratrol). We show that the intraperitoneal administration of 500 mg/kg body weight/day of NMN during eight weeks induces a mild amelioration of the ataxic behavior of transgenic MJD mice, with no significant alterations in the neuropathology. Importantly, we observed that eight weeks of intraperitoneally-administered resveratrol at a dose of 10 mg/kg body weight/day in transgenic MJD mice, robustly alleviates motor incoordination and imbalance. Moreover, resveratrol treatment also ameliorates the accompanying neuropathology. Altogether, these results highlight the relevance of the use of resveratrol as a therapy to treat MJD. At the end, in Chapter 5, we provide a final discussion, conclusion, and future perspectives about the results presented in Chapters 2, 3, and 4. In conclusion, with this work we present evidence that SIRT1 activation with caloric restriction or resveratrol, is a promising therapeutic strategy to treat MJD or to delay MJD progression. Furthermore, we also unravel a new pathway related with the mitochondrial dysfunction patent in the disease, creating new potential targets to guide new therapeutic approaches for MJD.

A doença de Machado-Joseph (DMJ), também conhecida por ataxia espinocerebelosa do tipo 3, é uma doença neurodegenerativa autossómica dominante fatal. A DMJ é causada pela expansão do trinucleótido CAG na região codificante carboxi-terminal do gene ATXN3, localizado no cromossoma 14q32.1. O gene ATNX3 apresenta de 12 a 44 repetições CAG mas a mutação no gene ATXN3 resulta em 55 a 86 repetições CAG, no exão 10. A ataxina-3 mutante resultante apresenta um aumento do número de repetições de glutamina, podendo interagir com outras proteínas, sendo acumulada na forma de agregados no cérebro, mais abundantemente nos núcleos dos neurónios. As principais regiões cerebrais afetadas na DMJ são o cerebelo, o tronco cerebral e os gânglios da base, incluindo a substantia nigra e o estriado. Esta doença é a ataxia dominante mais comum em todo o mundo, sendo uma doença de início tardio que se manifesta com ataxia cerebelosa, rigidez e atrofias musculares distais. Presentemente não existe nenhuma terapia para curar ou atrasar a progressão da DMJ. A restrição calórica (RC) é uma abordagem experimental conhecida à mais de 80 anos que aumenta a longevidade de diferentes espécies animais usadas em laboratório. Para além disso, estudos demonstram que a RC poderá ter efeitos neuroprotetores. Os mecanismos que estão na base dos efeitos benéficos da RC são diversos. Um dos mais importantes mecanismos consiste no efeito da RC nos níveis e na atividade das sirtuínas. As sirtuínas são desacetilases dependentes de NAD+, existindo sete sirtuínas nos mamíferos (SIRT1-7). A SIRT1, que é a sirtuína mais estudada até agora, medeia os efeitos da RC, dado que a RC tem a capacidade de aumentar os seus níveis e atividade. Nesta tese os principais objetivos consistiram na avaliação do potencial efeito benéfico da RC na DMJ e do papel da SIRT1 nesses efeitos, e também na investigação dos mecanismos associados com a disfunção mitocondrial patente na patogénese da DMJ. Para isto recorremos a modelos celulares e de murganho da DMJ. Esta tese está organizada em cinco capítulos. No Capítulo 1 apresenta-se uma revisão da literatura da DMJ, da RC e das sirtuínas, mais particularmente da SIRT1. No Capítulo 2 avaliamos o papel da RC em dois modelos de murganho da DMJ, e estudamos a contribuição da SIRT1 para esses efeitos. Os resultados obtidos demonstram que a RC melhora os problemas motores e a neuropatologia associada à DMJ. Além disso, demonstramos que a SIRT1 está envolvida nesses efeitos visto que a sua redução bloqueia os efeitos benéficos da RC. A sobrexpressão específica e localizada da SIRT1 melhora significativamente a neuropatologia do modelo animal da DMJ. Adicionalmente, os nossos resultados sugerem que a SIRT1 tem a capacidade de ativar a autofagia, contribuindo para a degradação das espécies tóxicas da ataxina-3 mutante e para a redução da neuroinflamação associada à DMJ. No Capítulo 3 estudamos a relação existente entre o núcleo e a mitocôndria em modelos experimentais da DMJ. Os nossos resultados sugerem que a alteração da comunicação núcleo-mitocôndria, desencadeada pela redução do NAD+, está associada à disfunção mitocondrial presente na DMJ. Para além disso, clarificamos que esta redução provavelmente está relacionada ao aumento do consumo de NAD+, dado o aumento do cluster de diferenciação 38 (CD38), e o comprometimento da via de regeneração do NAD+, pela redução da nicotinamida mononucleótido adenililtransferase 1 (NMNAT1). Além disso, os nossos resultados ainda sugerem que a sobrexpressão do NMNAT1 tem a capacidade de restabelecer a comunicação núcleo-mitocôndria e consequentemente a respiração mitocondrial. No Capítulo 4 avaliamos os possíveis efeitos benéficos resultantes do aumento farmacológico do NAD+, recorrendo à administração periférica de nicotinamida mononucleótido (NMN) ou resultantes da ativação da SIRT1 pela administração periférica de resveratrol. Neste capítulo observamos que o tratamento diário de murganhos transgénicos para a DMJ com NMN (500 mg/kg peso corporal/dia) administrado por via intraperitoneal durante oito semanas, induz uma ligeira melhoria da ataxia motora, sem alterações significativas da neuropatologia. Contudo, observamos que o tratamento diário dos murganhos transgénicos para a DMJ com resveratrol (10 mg/kg peso corporal/dia), administrado por via intraperitoneal durante oito semanas, melhora a descoordenação motora e o desequilíbrio característicos da doença. Para além disso, o resveratrol melhora a neuropatologia associada. Em conjunto, estes resultados salientam a relevância do uso do resveratrol como terapia para a DMJ. No Capítulo 5 elaboramos uma discussão geral, conclusão final e perspetivas futuras, relativas aos resultados apresentados nos Capítulos 2, 3 e 4. Em conclusão, nesta tese demonstramos que a ativação da SIRT1 através da restrição calórica ou da administração do resveratrol, são estratégias terapêuticas promissoras, para tratar e/ou atrasar a progressão da DMJ. Além disso, nesta tese sugerimos um novo mecanismo relacionado com a disfunção mitocondrial que ocorre na doença, criando novos potenciais alvos farmacológicos de modo a auxiliar o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para a DMJ.