Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/32054
Title: Quantifying triglyceride futile cycling with deuterated water and 2H NMR anlysis of glycerol 2H enrichment
Authors: Santos, Cátia Marília Marques 
Orientador: Jones, John G.
Tomé, Ângelo
Keywords: Transesterificação; Ciclo fútil dos triglicerídeos; 2H RMN
Issue Date: 2015
Citation: SANTOS, Cátia Marília Marques - Quantifying triglyceride futile cycling with deuterated water and 2H NMR anlysis of glycerol 2H enrichment. Coimbra : [s.n.], 2015. Dissertação de Mestrado em Bioquímica (Metabolismo)
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: O “Ciclo Fútil” entre triglicerídeos e ácidos gordos tem sido proposto como um mecanismo de dissipação de energia em organismos vivos. O nosso laboratório desenvolveu um método que permite a quantificação do fluxo deste ciclo utilizando água deuterada (2H2O) para marcar triglicerídeos. Este método baseia-se na análise do enriquecimento com deutério da fracção do glicerídeo através de 2H RMN. O principal objectivo desta dissertação de mestrado era desenvolver um método melhorado para a análise do enriquecimento de 2H no local já referido, uma vez que, com a análise de triglicerídeos já existente, os sinais do espectro de 2H-RMN correspondentes à marcação do glicerídeos são muito largos e difíceis de quantificar devido à sua restrição de movimento. Com o intuito de melhorar a quantificação destes sinais, desenvolvemos protocolos que permitem uma transesterificação dos triglicerídeos com rendimentos elevados obtendo o glicerol isolado, cujos sinais de 2H-RMN são mais estreitos e têm uma melhor resolução quando comparados com os sinais equivalentes na molécula de triglicerídeos inicial. Tendo em conta que a análise de 2H-RMN do glicerol foi feita em água, nós testámos a hexafluoroacetona visto que é um composto de flúor alternativo ao hexafluorobenzeno – composto não solúvel em água. Nós aplicámos este método para quantificar o ciclo fútil de triglicerídeos/ácidos gordos em tecido adiposo de duas estirpes diferentes de ratos (ratos AJ – modelo de resistência à obesidade – e ratos B6 – modelo com tendência à obesidade) expostos a temperaturas baixas durante 7 dias com o objectivo de estimular o ciclo fútil referido no tecido adiposo e os mecanismos de produção de calor. Com a optimização do protocolo de transesterificação, os rendimentos médios de extracção do glicerol foram de 80% comparando com a quantidade inicial de triglicerídeos. Tal indica que esta abordagem permite a preservação da quantidade de amostra para análise por RMN. Os espectros de 2H RMN dos triglicerídeos mostram a existência de dois picos, um corresponde à marcação de deutério na posição do carbono 2 da fracção do glicerídeos e o outro representa a marcação de deutério nos carbonos das posições 1 e 3 da fracção em estudo. As larguras dos sinais a uma altura média, para cada pico, são 19,46 Hz e 14,23 Hz, respectivamente. Após a transesterificação, os espectros de 2H RMN correspondentes ao glicerol isolado apresentam três picos distintos, um corresponde à marcação com deutério no carbono 2 e os outros dois correspondem aos hidrogénios proquirais R e S ligados aos carbonos 1 e 3. Nesta análise, as larguras dos sinais a média altura são 3,41 Hz, 3,68 Hz e 3,85 Hz, respectivamente. Estes sinais são mais estreitos e resultam numa quantificação mais precisa do enriquecimento da porção do glicerídeo dos triglicerídeos. Para a estirpe AJ, a taxa de marcação da porção do glicerídeo dos triglicerídeos foi 3,24 ± 0,88% e 16,62 ± 2,63% para o grupo controlo e para o grupo exposto a temperaturas baixas durante 7 dias, respectivamente. A taxa de marcação para a estirpe B6 foi de 3,63 ± 1,38% e 10,03 ± 2,29%, respectivamente para os mesmos grupos. No entanto, para os grupos expostos a temperaturas baixas durante 7 dias, a estirpe AJ teve uma taxa de marcação significativamente maior comparando com a estirpe B6 (P < 0,0001). Isto pode estar relacionado com a menor eficiência metabólica da estirpe AJ versus estirpe B6, que por sua vez protege a estirpe AJ contra obesidade induzida pela dieta.
“Futile cycling” between triglyceride and fatty acids has been proposed as a mechanism for energy dissipation in living organisms. Our laboratory has developed a method for quantifying this rate of cycling using deuterated water (2H2O) to label triglycerides. This method was based on the analysis of 2Henrichment in the glyceride moiety by 2H NMR. The main goal of this Master dissertation was to develop an improved method for analysing 2H-enrichment in this site, since with existing triglyceride analysis, the glyceride 2H NMR signals are very broad and difficult to quantify due to their restricted motion. We therefore developed protocols to quantitatively transesterify triglycerides yielding free glycerol, whose 2H NMR signals are narrower and better resolved compared to those of the intact triglyceride. Since the glycerol 2H NMR analysis was performed in water, we tested hexafluoroacetone, an alternative fluorine lock compound to the hexafluorobenzene currently in use –but which is not water soluble. We applied this analysis to quantify triglyceride/fatty acid futile cycling in adipose tissue of two mice strains (AJ mice - models of obesity-resistant- and B6 mice - models of obesity-prone animals) that were exposed to 7 days of cold in order to stimulate adipocyte futile cycling and heat generation pathways. Following optimization of the transesterification protocol, we were able to obtain average glycerol yields of 80% that of the starting triglyceride material indicating that this approach was suitable for preservation of sample mass for effective NMR analysis. The 2H NMR spectrum of triglycerides shows two different peaks, one corresponds to the deuterium labelling in the carbon 2 of glyceride moiety and the other represents deuterium labelling in carbons 1 and 3 of the same moiety. The linewidths at half height for each peak are 19,46 Hz and 14,23 Hz, respectively. After the transesterification process, the 2H NMR spectrum of isolated glycerol shows 3 distinct peaks, one still corresponds to the deuterium labelling in the carbon 2 and two others corresponding to the prochiral R and S hydrogens bound to carbons 1 and 3. In this analysis, the linewidths at half height are 3,41 Hz, 3,68 Hz and 3,85 Hz, respectively. These narrower 2H NMR signals resulted in more precise measurements of triglyceride glyceryl 2H enrichment. For the AJ strain, the fractional turnover rate of triglyceride glycerol, expressed in percent, were 3,24 ± 0,88% and 16,62 ± 2,63% for the control and 7 days cold exposure, respectively. For the B6 strain fractional turnover rates of 3,63 ± 1,38% and 10,03 ± 2,29% were obtained for control and 7 days cold exposure, respectively. Thus, AJ mice had significantly higher triglyceride turnover at 7 days cold exposure compared to B6 (P < 0,0001). This may be related to the reduced metabolic efficiency of AJ versus B6 mice that in turn may better protect the AJ strain against diet-induced obesity.
Description: Dissertação de Mestrado em Bioquímica (Metabolismo), apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
URI: http://hdl.handle.net/10316/32054
Rights: openAccess
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