Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/31713
Title: Screening of biotechnological potential of Osmundea pinnatifida: cultivation trials and biological activities
Authors: Silva, Paulo Jorge Ferreira da 
Orientador: Pereira, Leonel
Pedrosa, Rui Filipe Pinto
Keywords: Macroalga edível; Atividade antioxidante; Atividade antitumoral; Atividade antifúngica; Aspergillus fumigatus
Issue Date: 2015
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: Wild and integrated multi-trophic aquaculture (IMTA) samples of the Portuguese edible seaweed Osmundea pinnatifida were screened for antioxidant, antitumor and antimicrobial (antibacterial and antifungal) activities. Extracts were obtained using solvents with different polarity, namely methanol, dichloromethane and n-Hexane. The antioxidant activity was assessed through the 2,2-diphenly-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity and oxygen radical absorbance capacity (ORAC) methods. Total phenolic content (TPC) was also estimated. The antitumor activity was evaluated in HepG-2, MCF-7 and SH-SY5Y cell lines through the 3-[4, 5-dimethylthiazol2-yl]-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay. The antibacterial activity was assessed against Escherichia coli and Staphylococcus aureus through a standardized broth microdilution assay. In turn, antifungal activity against Candida albicans was studied using the standardized disk diffusion and broth microdilution; and also against Alternaria infectoria and Aspergillus fumigatus through radial growth inhibition and standardized broth microdilution assays, specific to filamentous fungi. Light, confocal and fluorescence microscopy observation, along with cell wall chitin and β-glucan quantification were also used to study the effect of the extracts on the A. infectoria and Asp. fumigatus fungal cell wall and morphology. Among the solvents used for extraction, dichloromethane was the most effective to extract phenolic compounds in both samples. It were accounted 46.82 mg gallic acid equivalents (GAE)/g of dry extract in dichloromethane extract of wild sample (Dw) and 43.48 mg GAE/g in dichloromethane extract of IMTA-cultivated (Dc). The highest ORAC was also verified in the dichloromethane extracts (Dw: 414 μmol trolox equivalents (TE)/g; Dc: 499.9 μmol TE/g), evidencing a high correlation with the TPC content (r=0.9499, P<0.01) which was also sustained by the principal components analysis (PCA). The tested extracts were weak DPPH radical scavengers due to the high EC50 values obtained (>900 μg/mL). However, the effect of some fractions was dose-dependent. Dichloromethane extracts promoted a cytostatic effect on MCF-7 cells. Additionally, they shown cytotoxicity in SH-SY5Y cells and inhibited its proliferation. Dc presented higher cytotoxicity (IC50: 923.6 μg/mL) whereas Dw was more effective (IC50: 508.8 μg/mL) in inhibiting SH-SY5Y cells proliferation. All this effects were dose-dependent. Overall, there were no statistically significant differences (P>0.05) in the antioxidant and antitumor activities shown by the wild and IMTA-cultivated samples. The n-Hexane fraction of the wild seaweed (Hw) inhibited the sporulation of A. infectoria in RPMI medium at 30 μg/mL and also induced a statistically significant (P< 0.01) decrease in β-glucan content in mycelium grown in YME at the same concentration. All the studied extracts inhibited the radial growth of Asp. fumigatus in PDA. n-Hexane fractions at 100 μg/mL were the most effective (Hw: 14.64%; Hc: 19.83%). Furthermore, liquid cultures in YME supplemented with 100 μg/mL of Dw and 30 μg/mL of Hw showed abnormal conidial heads, completely devoid of conidia. Asp. fumigatus grown in YME supplemented with 100 μg/mL of Dw and with 100 μg/mL of Dc induced a statistically significant (P<0.01 and P<0.03, respectively) reduction in chitin content. Asp. fumigatus treated with 30 μg/mL of Hw also presented decreased chitin contents, although not significant. Thus, the present study reveals Osmundea pinnatifida as a promising source of biologically active compounds with interest for further biotechnological applications.
A Osmundea pinnatifida é uma espécie de alga vermelha edível abundante na costa portuguesa. Amostras selvagens e cultivadas em aquacultura multitrófica integrada (AMTI) foram avaliadas quanto à suas atividades antioxidante, antitumoral e antimicrobiana (antibacteriana e antifúngica). Os extratos foram obtidos através um processo de extração sequencial, no qual foram usados solventes orgânicos de diferentes polaridades, nomeadamente metanol, diclorometano e n-Hexano. A atividade antioxidante foi avaliada através de métodos in vitro. Foram usados os métodos do DPPH (2,2-diphenly-1-picrylhydrazyl) e índice ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity). O conteúdo em polifenóis foi também estimado através do método de Folin-Ciocalteu. Por sua vez, a atividade antitumoral foi avaliada em três linhas celulares, HepG-2, MCF-7 e SH-SY5Y, através do método MTT (3-[4, 5-dimethylthiazol2-yl]-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide). A atividade antibacteriana foi avaliada contra Escherichia coli e Staphylococcus aureus através do método standardizado da microdiluição em meio líquido. A atividade antifúngica contra Candida albicans foi estudada usando métodos standardizados – difusão em disco e microdiluição em meio líquido. Foi também aferida a atividade antifúngica contra os fungos filamentosos Alternaria infectoria e Aspergillus fumigatus através da inibição do crescimento radial e do método standardizado de microdiluição em meio líquido, específico para fungos filamentosos. Observações em microscopia ótica, confocal e de fluorescência, juntamente com a quantificação dos conteúdos em quitina e em β-glucano, foram também usados para estudar o efeito dos extratos na parede celular de A. infectoria e Asp. fumigatus. Entre os solventes usados na extração, o de diclorometano foi o mais eficaz na extração de compostos fenólicos em ambas as amostras. Para o extrato de diclorometano da amostra selvagem (Dw) foram determinados 46,82 mg de equivalentes em ácido gálico (EAG)/g de extrato seco, enquanto que para o extrato de diclorometano da amostra cultivada em AMTI (Dc) o conteúdo em fenóis foi estimado em 43,48 mg EAG/g. O índice ORAC mais elevado também foi verificado nos extratos de diclorometano (Dw: 414 μmol de equivalentes de trolox (ET)/g; Dc: 499,9 μmol ET/g), evidenciando uma elevada correlação com o conteúdo total em polifenóis (r=0,9499; P<0,01), que foi corroborada pela análise de componentes principais. Os extratos testados apresentaram uma fraca capacidade de reduzir o radical DPPH devido aos valores elevados de EC50 obtidos (>900 μg/mL). No entanto, o efeito de algumas frações dependente da concentração. Os extratos de diclorometano promoveram um efeito citostático nas células MCF-7. Para além disso, estes extratos exibiram citotoxicidade em células SH-SY5Y e inibiram a sua proliferação. Dc apresentou uma citotoxicidade maior (IC50: 923,6 μg/mL), enquanto que Dw foi mais eficaz (IC50: 508,8 μg/mL) na inibição da proliferação em células SH-SY5Y. Estes efeitos demonstraram ser dependentes da concentração. No geral, não se verificaram diferenças estatisticamente significativas (P>0,05) entre a amostra selvagem e a cultivada em AMTI ao nível das atividades antioxidante e antitumoral. A fração de n-Hexano da alga selvagem (Hw) inibiu a esporulação de A. infectoria em meio RPMI a 30 μg/mL. Para além disso, induziu um decréscimo estatisticamente significativo (P<0,01) no conteúdo em β-glucano no micélio crescido em meio YME, à concentração referida anteriormente. Todos os extratos em estudo inibiram o crescimento radial de Asp. fumigatus em PDA. Entre eles, as frações de n-Hexano a 100 μg/mL foram as mais eficazes (Hw: 14,64%; Hc: 19,83%). Para além disso, culturas líquidas em meio YME suplementado com 100 μg/mL de Dw e 30 μg/mL de Hw evidenciaram cabeças aspergilares anormais, completamente desprovidas de conídios. Asp. fumigatus crescido em meio YME suplementado com 100 μg/mL de Dw e com 100 μg/mL de Dc induziram uma redução estatisticamente significativa (P<0,01 e P<0,03) nos conteúdos de quitina. Asp. fumigatus tratados com 30 μg/mL de Hw também apresentou um decréscimo nos conteúdos de quitina, apesar de não ser significativo. Assim, o presente estudo revelou a Osmundea pinnatifida como uma fonte bastante promissora de compostos biologicamente ativos com interesse para futuras aplicações biotecnológicas.
Description: Dissertação de Mestrado em Biodiversidade e Biotecnologia Vegetal, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
URI: http://hdl.handle.net/10316/31713
Rights: openAccess
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