Altering protein degradation via the ubiquitin proteasomal system or autophagy, and its impact on tau degradation and aggregation

Abstract

Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder that places a substantial burden on patients, their families, and society. One of the several pathological hallmarks of this disease is intraneuronal phospho-tau accumulation in the form of neurofibrillary tangles. Tau is an intracellular protein that contributes to the stabilization and assembly of microtubules (MT) in neuronal axons, neurite outgrowth, axonal transport, cell signaling transduction, trophic signaling enhancement and heat shock cell protection. The interaction of tau with MTs is regulated through many mechanisms including alternative splicing and phosphorylation, the latter being fundamental in AD since the characteristic tangles seen in this disease are composed by filaments of abnormally phosphorylated tau. Paired helical filaments-tau (PHF-Tau) is ubiquitinated at its microtubule-binding domain at different residues, suggesting that ubiquitination of PHF-Tau may be an earlier pathological event and that ubiquitination could play a regulatory role in modulating the integrity of microtubules during the course of AD. Protein aggregate formation may be linked to misregulation of the ubiquitin proteasome system (UPS) and/or the autophagy pathway. UPS is usually responsible for degradation of many long-lived proteins and damaged organelles, while autophagy is usually related with degradation of short-lived proteins. Degradation targets must first be ubiquitin-tagged, a highly regulated process itself that requires a delicate balance between ubiquitinating and de-ubiquitinating enzymes (DUBs). USP5, USP7, OTUB1 and USP9x are the four DUBs studied in this project. In these work we showed that mutations of the known ubiquitination sites Lys254, Lys257, Lys311, Lys317 and Lys353 to prevent ubiquitination do not play a critical role in soluble or insoluble tau degradation or preventing its buildup in our cellular model; we show that overexpression of USP5 and OTUB1 attenuates the formation of tau aggregates or enhances its clearance.

A doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa com elevado impacto para os pacientes, para os seus familiares e para a sociedade. Uma das características patológicas desta doença é a acumulação intraneuronal da proteína tau fosforilada, na forma de tranças neurofibrilares. A tau é uma proteína intracelular que contribui para a formação dos micrrotúbulos (MT) e a sua estabilização nos axónios, assim como para o crescimento das neurites, transporte axonal, sinalização intracelular, aumento de sinalização trófica e protecção celular heat shock. A interacção da tau com os MTs é regulada através de diversas formas, incluindo splicing alternativo e fosforilação, sendo este último processo fundamental na DA visto que as tranças características desta doença são compostas por filamentos de tau anormalmente fosforilada. Filamentos helicoidais de tau emparelhados (FHE-tau) são ubiquitinados em diferentes locais, no domínio de ligação da proteína aos microtúbulos, sugerindo que a ubiquitinação dos FHE-tau pode ser um acontecimento patológico primário e que este processo pode afectar a integridade dos microtúbulos durante o desenvolvimento da DA. A formação de agregados de proteínas pode estar relacionada com a falha de regulação do sistema de ubiquitina-proteossoma (SUP) e/ou a falha na autofagia. O SUP é geralmente responsável pela degradação de várias proteínas de elevada estabilidade assim como de organelos danificados, enquanto que a autofagia é geralmente responsável pela degradação de proteínas com uma meia-vida curta. As proteínas degradadas pelo SUP são primeiro marcadas com ubiquitina, um processo altamente regulado que requer um equilíbrio meticuloso entre a actividade das enzimas que promovem ubiquitinação e as que promovem a desubiquitinação (DUBs). USP5, USP7, OTUB1 e USP9x são as quatro DUBs estudadas neste projecto. Neste trabalho foi mostrado que mutações na tau, nos locais de ubiquitinação conhecidos Lys254, Lys257, Lys311, Lys317 e Lys353, de modo a impedir a ubiquitinação da proteína, não alteram de forma significativa a degradação da proteína, quer esta esteja na forma solúvel ou insolúvel, e também não alteraram a sua agregação no modelo utilizado. Mostrámos também que o aumento da expressão da USP5 e da OTUB1 atenua a formação de agregados ou aumenta sua degradação.