Phenolic characterization and evaluation of the antioxidant and anti-inflammatory properties of Eriocephalus africanus and Geranium robertianum extracts

Abstract

Introdução: As plantas medicinais têm vindo a ser reconhecidas e utilizadas ao longo da história da humanidade pelos seus efeitos terapêuticos e curativos. Estas plantas conseguem sintetizar uma grande variedade de fitoquímicos biologicamente ativos, dos quais se podem destacar os compostos fenólicos. Visto que estes constituintes têm sido intimamente associados a propriedades benéficas para a saúde, um crescente interesse tem-lhes sido prestado por parte de vários investigadores. Dentro dos diferentes benefícios atribuídos aos compostos fenólicos, podem destacar-se as atividades antioxidantes e anti-inflamatórias. De acordo com o que tem vindo a ser descrito, estes compostos conseguem atenuar os efeitos negativos em condições de stress oxidativo através de mecanismos de sequestro de diferentes espécies reativas e atividade quelante de metais pesados, bem como intensificação da atividade de várias enzimas antioxidantes endógenas tais como a superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GSH-px) e a catalase (CAT), ou ainda inibindo vias de sinalização pró-inflamatórias que incluem o óxido nítrico (NO●), oxido nítrico sintase induzível (iNOS), cicloxigenase-2 (COX- 2), lipoxigenase (LOX) e fator nuclear-κB (NF-κB). Eriocephalus africanus e Geranium robertianum são duas espécies de plantas que têm sido muito utilizadas na medicina tradicional devido às suas aclamadas propriedades benéficas. Como tal, neste trabalho pretendeu-se avaliar as suas capacidades antioxidantes e anti-inflamatórias, com o intuito de perceber se existe potencial para que estas plantas possam vir a ser exploradas com fins terapêuticos ou como formulações para nutracêuticos. Métodos: As propriedades antioxidantes dos extratos hidroetanólicos das folhas e caules de Eriocephalus africanus (EAL e EAS, respetivamente) e Geranium robertianum (GRL e GRS, respetivamente) foram avaliadas pelos métodos DPPH●, ABTS●+, OH●, NO●, TBARS, FRAP e ORAC. Uma vez que estes produtos podem vir a ser integrados na dieta humana, possíveis efeitos citotóxicos foram avaliados em linhas celulares de hepatócitos. Para a análise das propriedades anti-inflamatórias dos extratos, testaram-se as amostras investigando os seus efeitos inibidores da atividade da 5-LOX, através da medição espectrofotométrica da taxa de oxidação do linoleato, e produção de NO● pelos macrófagos RAW 264.7 usando o método de Griess. A concentração de amostra que revelou uma melhor inibição dos níveis de nitritos foi também testada no que diz respeito aos seus efeitos sobre as enzimas ativadas durante a inflamação, nomeadamente iNOS e COX-2, através do método de Western blot recorrendo a anticorpos específicos. A identificação e quantificação dos compostos fenólicos de cada extrato foram conseguidas recorrendo ao método de Folin-Ciocalteu e através da análise por HPLC-DADESI/ MSn, respetivamente. II Resultados: A atividade antioxidante mais promissora foi registada para o extrato GRL, tendo obtido os menores valores de IC50 para quase todos os ensaios (7.6±0.6, 3.9±0.6, 45.1±2.4, 20.0±0.9, 115.8±16.1 and 63.3±5.4 μg/mL para DPPH●, ABTS●+, OH●, NO●, TBARS e FRAP, respetivamente). Verificou-se uma exceção no método ORAC no qual o extrato EAS demonstrou possuir o dobro do poder antioxidante das restantes amostras (4.01±0.3 μM ET). Numa perspetiva geral, a segunda amostra mais promissora foi o extrato GRS seguido do extrato EAS. Globalmente, o extrato EAL foi o que obteve resultados menos promissores, e por isso foi excluído das análises posteriores. Nenhum dos extratos de G. robertianum e EAS revelou hepatotoxicidade sugerindo que as concentrações usadas (25 – 100 e 50 – 200 μg/mL, respetivamente) são inócuas. Na concentração de 75 μg/mL, ambos os extratos de G. robertianum inibiram aproximadamente 65% da atividade da 5-LOX enquanto o extrato EAS demonstrou uma inibição inferior (30%) para a mesma concentração. Mais ainda, este último extrato não revelou efeito na produção de nitritos em macrófagos estimulados com LPS para concentrações de 50 – 200 μg/mL. Por outro lado, ambos os extratos de G. robertianum, numa concentração de 100 μg/mL, demonstraram efeito inibidor na produção de NO● por parte dos macrófagos estimulados com LPS. No entanto, para esta mesma concentração verificou-se um decréscimo da viabilidade nas células tratadas com o extrato GRL, pelo que apenas o extrato GRS foi sujeito à análise por Western blot. No entanto, os dados recolhidos permitiram concluir que o extrato GRS (a 100 μg/mL) não causou inibição significativa nos níveis de iNOS ou COX-2. Adicionalmente, a quantificação do teor total de compostos fenólicos de todos os quatro extratos revelou que a amostra com maior abundância destes compostos foi o extrato GRL (462 mg EAG/g de matéria seca), seguido pelos extratos EAS>GRS=EAL. Apesar das ligeiras variações nas intensidades dos picos, os perfis cromatográficos entre extratos da mesma planta revelaram-se semelhantes. Os extratos de E. africanus são particularmente ricos em ácidos clorogénicos e seus derivados, sendo que os dois maiores picos de ambos os extratos desta planta correspondem aos ácidos 3-cafeioilquínico e 3,5-dicaffeioilquínico. Um terceiro pico demonstrou-se relevante apenas no extrato EAL, tendo sido identificado como eriodictiol-hexuronídeo. Outros compostos minoritários foram também identificados nestes extratos, nomeadamente derivados de hesperetina, eriodictiol, ácidos cafeico, ferúlico e protocatecuico. Por outro lado, os extratos de G. robertianum revelaram-se mais enriquecidos em derivados de ácido elágico e gálico. Os três maiores picos destes extratos corresponderam a ácido carboxílico de brevifolina, ácido elágico e galoil-HHDP-hexosídeo. O ácido cafeioilquínico também foi detetado nos extratos de G. robertianum, bem como o ácido 3,4-dihidroxifenilacético, embora tenham sido considerados como compostos minoritários. III Conclusões: Globalmente, os extratos de ambas as plantas E. africanus and G. robertianum exibiram boas propriedades antioxidantes, sendo que o extrato de GRL demonstrou ser o mais promissor entre os quatro, provavelmente pelo seu teor mais elevado em compostos fenólicos. Além disso, apenas os extratos de G. robertianum, particularmente o extrato GRS, revelaram uma significativa capacidade inibidora da produção de nitritos pelos macrófagos RAW 264.7. Esta inibição não foi no entanto acompanhada pela diminuição nos níveis intracelulares de iNOS e/ou COX-2, presumindo-se assim que as propriedades anti-inflamatórias deste extrato são resultado apenas dos seus mecanismos de sequestro de radicais que são produzidos durante a inflamação

Introduction: Medicinal plants have been identified and used throughout human history because of their therapeutic and healing effects. These plants can synthesize a wide variety of biological active phytochemicals from which phenolic compounds can be distinguished. Because these compounds have been closely associated with health promoting effects, they have drawn researchers increasing attention. Among the various health benefits attributed to the phenolic compounds, their antioxidant and anti-inflammatory properties have gathered particular interest. It has been described that they can effectively attenuate the oxidative stress imbalance through the scavenging of different reactive species and heavy metal chelating mechanisms, as well as enhancing the endogenous antioxidant enzymes including superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidade (GSH-px), and catalase (CAT), or inhibiting pro-inflammatory signaling pathways and mediators including nitric oxide (NO●), inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2), lipoxygenase (LOX) and nuclear factor- κB (NF- κB). Eriocephalus africanus and Geranium robertianum are two plant species that have been long used in traditional medicine due to their claimed beneficial properties. Therefore, this work intended to evaluate the safety profile of the hydroethanolic extracts obtained from Eriocephalus africanus and Geranium robertianum to human cells, their antioxidant and anti-inflammatory abilities, and to disclose the mechanism of action behind its bioactivity in order to understand if there is potential to exploit these plants for putative therapeutic uses or nutraceutical formulations. Methods: The antioxidant properties of the hydroethanolic extracts from leaves and stems of Eriocephalus africanus (EAL and EAS, repectively) and Geranium robertianum (GRL and GRS, respectively) were evaluated through DPPH●, ABTS●+, OH●, NO●, TBARS, FRAP and ORAC assays. Since these products can be used in human diet, possible cytotoxic effects on hepatocytes were also evaluated. To analyze the anti-inflammatory potential of the extracts, samples were tested for their ability to inhibit 5-LOX activity, through the spectrophotometric measurement of the rate of linoleate oxidation, and the NO● release by macrophages, through the Griess method. The sample conditions that revealed inhibition of the NO● levels were also evaluated with regard to effects on the levels of intracellular enzymes triggered during inflammation, namely iNOS and COX-2, through Western blot using specific antibodies. Quantification and identification of the phenolic compounds of each extract were also achieved through Folin-Ciocalteu and HPLC-MSn analysis, respectively. VI Results: The most promising antioxidant activity was registered for the GRL extract, which had the lowest IC50 values for almost every tests (7.6±0.6, 3.9±0.6, 45.1±2.4, 20.0±0.9, 115.8±16.1 and 63.3±5.4 μg/mL for DPPH●, ABTS●+, OH●, NO●, TBARS and FRAP assays, respectively). The only exception was in ORAC assay where the EAS extract has shown twice the antioxidant power of the remaining samples (4.01±0.3 μM TE). From a general perspective, the second most promising sample was the GRS extract followed by the EAS extract. Overall, EAL extract was the less promising extract, and therefore it was excluded from the subsequent studies. No hepatotoxic effects were noted for both G. robertianum and EAS extracts, suggesting that they are safe for the concentrations used (25 – 100 and 50 – 200 μg/mL, respectively). Both G. robertianum extracts at 75 μg/mL inhibited approximately 65 % the 5-LOX activity, while a moderate inhibition (30%) was noted for the EAS extract at the same concentration. Moreover, no effects on the NO● release by LPS-activated macrophages were evidenced for the latter extract, up to the concentrations 50 – 200 μg/mL. On the other hand, both G. robertianum extracts inhibited NO● release evoked by LPS-stimulated macrophages for the highest concentrations tested (100 μg/mL). Despite this, in GRL-treated cells, this concentration was also responsible for the decrease of their viability and therefore only GRS extract was submitted to Western blot analysis. The gathered results allowed to observe however, that the treatment of LPS-stimulated RAW 264.7 with 100 μg/mL of GRS extract did not induce significant inhibition of iNOS or COX-2. Additionally, the total phenolic quantification of the four extracts revealed that the most phenolic-enriched sample was the GRL extract (462 mg GAE/g of dry material), followed by EAS>GRS=EAL. Despite the slight variances in the peak intensities, the chromatographic profile between the extracts from the same plants were similar. E. africanus extracts were particularly rich in chlorogenic acid derivatives. The two main peaks identified in both samples correspond to 3-caffeoylquinic and 3,5-dicaffeoylquinic acids. A third relevant peak was also found in the EAL extract and was identified as eriodictyol-hexuronide. Other minor compounds namely hesperetin, eriodictyol caffeoyl, ferulic and protocatechuic derivatives have been identified as well. On the other hand G. robertianum extracts were more abundant in ellagic and gallic acid derivatives. The three main peaks disclosed correspond to brevifolin carboxilic acid, ellagic acid and galloyl-HHDP-hexoside. Caffeoylquinic acid was also present in these samples alongside with 3,4-dihydroxyphenylacetic acid, which have only been detected as minor compounds. Conclusion: Overall, both E. africanus and G. robertianum exhibited good antioxidant properties, but GRL extract was shown to be more effective than the others probably due to its higher content in phenolics. Moreover, only G. robertianum extracts, in particularly GRS VII have exerted significant inhibition of NO● production, but since no ingibitory effects have been observed in the levels of intracellular iNOS and COX-2, it is suggested that this extract may exert its anti-inflammatory abilities through the scavenging of the reactive species generated during inflammation