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Title: The role of autophagy and the lysosomal pathway in the clearance of Tau aggregates
Authors: Soares, Alberto José Carpinteiro 
Orientador: Buist, Arjan
Duarte, Carlos
Keywords: Doença de Alzheimer; Tau; Agregação da Tau; Degradação da Tau; Sistema autofagia-lisossoma
Issue Date: 2015
Citation: Soares, Alberto José Carpinteiro Soares - The role of autophagy and the lysosomal pathway in the clearance of Tau aggregates. Coimbra : [s.n.], 2015. Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular.
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: A proteína Tau é responsável pela ligação e estabilização dos microtúbulos (MT) no citoesqueleto, sendo fundamental na função neuronal. A atividade desta proteína pode ser regulada por modificações pós-translacionais, como a fosforilação, que promovem a separação dos microtúbulos. A alteração na conformação da Tau provocada por uma deficiente regulação, como a híper-fosforilação, causa destabilização dos MT e agregação da mesma em filamentos helicoidais emparelhados e tranças neurofibrilares. Estas estruturas são uma das principais características na doença de Alzheimer (AD), e o seu processo de formação pode representar um dos principais motivos que leva a morte celular nas Tauopatias, inclusivamente AD e outras patologias neurodegenerativas. Nos últimos anos, recursos têm sido empregues na descoberta de novas estratégias que permitam diminuir a formação ou diminuam a quantidade de agregados da Tau dentro das células. Estudos recentes identificaram a indução da autofagia através da rapamicina como um dos potenciais alvos no aumento da remoção de agregados proteicos associados a doenças neurodegenerativas, melhorando também a esperança de vida em ratos e outros modelos. Recentemente, o nosso laboratório desenvolveu um modelo celular baseado no trabalho de Guo e Lee (2011) que mimetiza a agregação intracelular da Tau depois de induzida a expressão de uma forma mutada desta proteína seguido do seeding com fibrilas K18:P301L pré-agregadas. Neste estudo, foi possível demonstrar como a utilização destes modelos permite identificar novos compostos com atividade nas vias de redução da Tau. Curiosamente estas moléculas foram responsáveis pelo desenvolvimento de um fenótipo vesicular que identificámos como sendo lisossomas, derivados de um possível estímulo na via endócitica. As alterações na morfologia sub-celular foram acompanhadas por modificações em marcadores de autofagia, sem aumento no fluxo autofágico. Estes dados sugerem que o aumento na degradação de proteínas e estruturas por autofagia poderão ter origem em efeitos colaterais de outras vias em detrimento do estímulo direto. Para além disso, testamos uma série de moléculas com atividade reconhecida e validadas para induzir autofagia ou bloquear a degradação no lisossoma. Foi demonstrado que no nosso modelo, a ativação da autofagia não é responsável pela remoção de agregados. Por outro lado, provámos que os lisossomas são extremamente importantes da degradação de agregados da Tau. Por fim, usámos o fator de transcrição EB (TFEB) para aumentar a biogénese de lisossomas e a autofagia. Células transfectadas com este fator apresentaram menos agregados de Tau e um aumento na viabilidade celular. Quando considerados em conjunto, estes resultados demonstram que a biogénese de lisossomas seguida por estímulos na autofagia podem ser mais importantes do que a ativação da autofagia por si só. Concluindo, com este projeto foi não só possível identificar os mecanismos dos compostos responsáveis pela degradação dos agregados de Tau, como também foi possível validar o TFEB como um potencial novo alvo na descoberta de novos fármacos.
Tau protein is responsible for binding and stabilizing microtubules (MT) in the cytoskeleton, thus supporting neuronal function. This protein activity can be regulated by post-translation modifications, such as phosphorylation, which promotes MT detachment. Tau misfolding provoked by abnormal regulation, like hyperphosphorilation, causes MT destabilization and Tau aggregation into paired helical filaments (PHF) and neurofibrillary tangles (NFTs). These structures are one of the main hallmarks in Alzheimer’s disease (AD), and its formation process may represent the principal motive for cell death in many Tauopathies, including AD and other neurodegenerative disorders. Over the last years, great efforts have been placed to find new strategies to either diminish the build-up or decrease the amount of aggregated Tau inside cells. Recent studies have identified induction of autophagy through rapamycin as a potential target in increasing the clearance of aggregated proteins associated with neurodegenerative diseases, as well as ameliorating life expectancy in rats and other animal models. Recently, our lab developed a cellular model based on the work by Guo and Lee (2011) that mimics the intracellular aggregation of Tau after overexpression of a mutated form of this protein and seeding with pre-aggregated K18:P301L fibrils. In this study, we have taken advantage of the developed model to discover new compounds active in Tau reduction pathways. Interestingly these molecules were responsible for the development of a vesicular phenotype that we identified as lysosomes due to a possible stimulation of the endocytic pathway. The change of the sub cellular morphology was followed by changes in autophagy markers, with no increase in the autophagic flux. This suggests an increment in the degradation of proteins and structures by autophagy as a collateral result from the activation of other pathways rather than a direct stimulus. Furthermore, we have tested a series of molecules with known and validated activity to induce autophagy or disable degradation via the lysosome. We showed that at least in our model, autophagy activation is not responsible for the clearance of aggregates. On the other hand, we have proven that lysosomes play a critical role in Tau aggregates degradation. Finally, we have used the transcription factor EB (TFEB) to intensify lysosomal biogenesis and autophagy. Cells transfected with this transcription factor had less Tau aggregates and cell viability was slightly increased. When considered together, these results show that lysosomal biogenesis followed by autophagy stimulation may be more important for clearance of Tau aggregates than autophagy by itself. In conclusion, we have not only determined the mechanisms targeted by the compounds responsible for the degradation of Tau aggregates, but also validated TFEB as a potential new target for drug discovery.
Description: Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida Da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
URI: http://hdl.handle.net/10316/30742
Rights: embargoedAccess
Appears in Collections:FCTUC Ciências da Vida - Teses de Mestrado

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