The osmoadaptative strategy of two slightly halophilic planctomycetes species

Abstract

Planctomycetes belong to a deep-branching group of Bacteria widely distributed in terrestrial and aquatic environments. The most intriguing features of the Planctomycetes are the multiplication by budding, the intracellular complex compartmentalization and the apparent lack of peptidoglycan in their cell walls. Such unusual characteristics increased their relevance in areas of research such as, evolution, cell biology, ecology and genomics. The two mesophilic and heterotrophic representatives of the phylum Planctomycetes used in this study were cultured from aquatic environments with highly contrasting characteristics; Gimesia maris (formerly named Planctomyces maris) was isolated from the estuarine system Puget Sound (Washington) in the Pacific Ocean and Rubinisphaera brasiliensis (formerly named Planctomyces brasiliensis) was obtained from Lagoa Vermelha, a salt pit near Rio de Janeiro, Brazil. Considering that G. maris and R. brasiliensis are distinct aquatic microorganisms, both species possess biochemical strategies that enable them to thrive under such conditions. The accumulation of organic molecules named compatible solutes is a common strategy among Bacteria to compensate lower extracellular water potential imposed by salt. The compatible solutes act as cell protectors without detrimental effects on normal cell metabolism. When present in the surrounding medium, compatible solutes can be taken up from the environment whereas their unavailability leads to de novo synthesis. Besides the Planctomycetes peculiar phylogenetic position, complete genomes available and distribution in several environments, the physiological mechanisms present in these organisms for the adaptation to diverse ecosystems are still poorly understood. Thus, the intracellular compatible solutes content from the slightly halophilic G. maris and R. brasiliensis species was analysed in detail in response to stressful conditions. For osmoadaptation both species accumulated α-glutamate, sucrose, ectoine and hydroxyectoine. In G. maris, α-glutamate remained the major solute at both sub-optimum and supra-optimum salinities, whereas in R. brasiliensis the levels of this amino acid were almost unchanged during growth at different salinities. Thus, the higher salt tolerance showed by R. brasiliensis could be related to the high ectoine concentration, which led to a much higher total compatible solutes content in the cells under supra-optimum salinities. In addition, sucrose up-regulation under nitrogen privation and during hyper-osmotic shock confirmed the osmoadaptation role of this disaccharide in R. brasiliensis. Surprisingly, sucrose became the major solute under nitrogen-limiting conditions suggesting that this disaccharide could be advantageous for cell revival after nitrogen reposition. In contrast, G. maris began to accumulate glucosylglycerate (GG) under nitrogen-limiting conditions. Thus, the accumulation of compatible solutes was intensively studied in G. maris under different stress conditions but the accumulation of GG was not detected in the presence of a nitrogen source. The identification of GG accumulation in G. maris specifically under nitrogen limiting conditions prompted us to analyse the transcript abundance of key genes known for the biosynthetic pathways of GG. Among them are a gpgS and a gpgP genes coding for a glucosyl-3-phosphoglycerate synthase and phosphatase, respectively, which are involved in the synthesis of GG by the common two-step pathway. Those genes are located in the G. maris genome as an operon-like structure along with a spasE gene coding for a putative sucrose phosphorylase (Spase), which we hypothesized to be involved in G. maris survival under nitrogen-limiting conditions. Via reverse transcription of total RNA from G. maris and subsequent qPCR analysis using suitable reference genes selected in this study, the transcript abundance of the biosynthetic genes was quantified in cells under hyper-osmotic shock or under nitrogen-limiting conditions. A clear dependence of the transcripts of gpgS and spasE genes to the shock treatment was shown with up-regulation under nitrogen-limiting conditions, suggesting a role for the putative Spase under those environmental conditions. The biosynthesis of GG under nitrogen-limiting conditions confirms the increase in gpgS transcript abundance and suggest that the synthesis of this glycerate-derivative is limited at first, by the transcriptional level of the gpgS gene. The production of GG and sucrose is therefore, mainly dependent on lower availability of a nitrogen source and subordinated to the osmolarity.

Os Planctomycetes constituem um grupo do domínio Bacteria de origem ancestral, amplamente distribuídos por ecossistemas terrestres e aquáticos. A multiplicação por gemulação, a estrutura celular compartimentalizada e a aparente ausência de peptidoglucano na parede celular são características determinantes dos Planctomycetes. Estas características apresentam relevância crescente em vários domínios científicos, como a evolução, biologia celular, ecologia e genómica. Os dois organismos em estudo são espécies mesófilas, heterotróficas, representativas do filo Planctomycetes, isoladas de ambientes aquáticos com características distintas, uma vez que Gimesia maris (anteriormente denominada Planctomyces maris) foi isolada do estuário Puget Sound em Washington e banhado pelo Oceano Pacifico e Rubinisphaera brasiliensis (anteriormente denominada Planctomyces brasiliensis) foi obtida da Lagoa Vermelha, uma lagoa hipersalina próxima do Rio de Janeiro no Brasil. Considerando que G. maris e R. brasiliensis são espécies de ambientes aquáticos distintos, ambas possuem estratégias bioquímicas que lhes permitam prosperar nesses ambientes. A acumulação de moléculas orgânicas designadas, solutos compatíveis é uma estratégia utilizada por diferentes organismos permitindo o equilíbrio osmótico das células. Os solutos compatíveis conferem proteção osmótica às células sem interferir com o metabolismo celular. Os solutos podem ser obtidos do exterior, quando presentes ou sintetizados pelas células em resposta a condições ambientais desfavoráveis. Apesar da posição filogenética do filo Planctomycetes, da disponibilidade de genomas completos de alguns representantes deste filo e da distribuição por diferentes ecossistemas, pouco se sabe sobre os mecanismos fisiológicos presentes nestes organismos para a adaptação a diferentes condições ambientais. Desta maneira, a acumulação de solutos foi analisada em G. maris e R. brasiliensis durante a resposta a condições de agressão osmótica. Em ambas as espécies, os solutos envolvidos na osmoadaptação são: α-glutamato, sacarose, ectoína e hidroxiectoína. Em G. maris, o α-glutamato permaneceu como soluto maioritário em condições de agressão sub-osmótica e supra-osmótica por outro lado, em R. brasiliensis os níveis deste aminoácido mantiveram-se quase inalterados em todas as salinidades testadas. A tolerância a salinidades mais elevadas demonstrada por R. brasiliensis estará relacionada com o aumento dos níveis de ectoína, que consequentemente aumentaram a concentração total de solutos nas células em condições de agressão supra-osmótica. Determinou-se ainda que a acumulação de sacarose é induzida pela ausência de azoto e em combinação com condições de agressão híper-osmótica, confirmando a importância deste dissacárido na osmoadaptação de R. brasiliensis. Para além disso, a sacarose foi o soluto maioritário durante a ausência de azoto, podendo conferir proteção às células, quando a fonte de azoto for reposta, de modo a retomarem rapidamente o normal metabolismo celular. Por outro lado, G. maris acumula glucosilglicerato (GG) durante a ausência de azoto. Deste modo, a acumulação deste soluto foi estudada em G. maris submetido a diferentes salinidades e combinado com diferentes condições de azoto mas este organismo não acumula GG na presença de fonte de azoto. A acumulação de GG por G. maris apenas na ausência de azoto levou-nos a analisar os níveis de transcrição de genes que codificam para a síntese de GG. Entre eles encontram-se os genes gpgS e gpgP que codificam para uma glucosil-3-fosfoglicerato sintetase e glucosil-3-fosfoglicerato fosfatase, respetivamente, que estão envolvidas na síntese de dois passos de GG em diferentes microrganismos. No genoma de G. maris, estes dois genes estão organizados numa estrutura semelhante a um operão juntamente com o gene spasE que codifica para uma provável sacarose fosforilase (Spase) e que possivelmente estará envolvida na sobrevivência de G. maris durante a ausência de azoto. Através da transcrição reversa do ARN total de G. maris e subsequente análise por qPCR usando genes de referência selecionados neste estudo, a abundância de transcritos da sequência codificante dos diferentes genes foi quantificada em células durante choque híper-osmótico ou durante a ausência de azoto. Demonstrou-se que a transcrição dos genes gpgS e spasE são dependentes do choque a que G. maris for exposto e que esta é induzida durante a ausência de azoto, sugerindo um papel importante da Spase em ambientes com baixa disponibilidade de azoto. A síntese de GG na ausência de azoto confirma a indução da transcrição do gene gpgS e sugere que a síntese de GG é limitada numa primeira fase pela abundância do transcrito do gene gpgS. A produção de GG e sacarose é por isso essencialmente dependente da baixa disponibilidade de uma fonte de azoto e subordinada pela osmolaridade.