Study of bioactive properties of Daucus carots subsp. carota extracts and essential oil

Abstract

Plants from the genus Daucus L., particularly the species Daucus carota, have been widely used over the millennia in folk medicine as treatment for dysentery and kidney dysfunction, amongst other ailments, These properties are based upon anecdotal evidence and many of them have not been validated using a scientific-based approach, thus justifying further investigations on the bioactive properties of these species. The work conducted in this thesis focuses on the taxon D. carota subsp. carota that grows spontaneously in Portugal. Essential oil and phenolic-enriched extracts obtained by extraction with 70% methanol, 100% methanol and water, from the aerial parts of D. carota subsp. carota, were used to access several bioactive properties, namely antibacterial, antifungal, antioxidant, anti-inflammatory and cytotoxicity ones. The antibacterial activity of the essential oil and the 70% methanol extract was evaluated against several pathogenic bacteria, through determination of the minimal inhibitory concentration (MIC) and minimal lethal concentration (MLC). The essential oil had a stronger activity when compared to the phenolic extract against Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes and Bacillus subtilis (MIC = 0.32 – 0.64 WL/mL versus 5-10 mg/mL). The bacteria Escherichia coli and Salmonella typhimurium were resilient against both samples. The antifungal properties of the samples were assessed against yeasts (Candida spp. and Cryptococcus neoformans), dermatophytes and Aspergillus spp. which are known to cause several pathologies both in humans and animals. The MIC and the MLC values showed a significant antifungal activity of the essential oil especially against dermatophytes (MIC = 0.32 – 0.64 WL/mL) and Cryptococcus neoformans (MIC = 0.16 WL/mL). The 70% methanol extract only demonstrated a significant activity against dermatophytes (MIC = 1.25 – 10 WL/mL). The inhibition of the germ tube formation and the effect on preformed biofilms of C. albicans was also conducted for the essential oil and the results suggest that it might be a promising therapy for candidiosis. The antioxidant capacity was also assessed in terms of radical scavenging using the ABTS cation radical scavenging assay and the ORAC assay. For the phenolic-enriched extracts the total phenolic content was also determined using the Folin-Ciocalteau assay. The total phenolic content on all tested samples was very similar between each other indicating that the phenolic compounds found in wild carrot have the same solubility in water and methanol. The ABTS and ORAC assays demonstrated that the phenolic-enriched extracts have a stronger antioxidant activity when compared to the essential oil, which was expected since phenolic XIX compounds are described as having more radical scavenging activity than terpenes and terpenoids. Prior to anti-inflammatory assays, NO● scavenging potential of D. carota subsp. carota was conducted using SNAP as a NO● donor. The essential oil was unable to scavenge the NO● released by SNAP. The anti-inflammatory activity of the essential oil was also performed by evaluating the capacity to inhibit the NO release in LSP-stimulated macrophages. The results show that the essential oil was able to decrease NO production by 19.04% without cytotoxicity to macrophages. In order to further evaluate the potential application of the essential oil in humans, the safety profile was determined using different cells (keratinocytes, alveolar epithelial cells, macrophages and hepatocytes) mimetizing the main administration routes and the metabolization in the organism (liver). The results demonstrated the essential oil in general was safe when applied in concentrations lower that 1.25 WL/mL. The present work contributed to a better understanding on the bioactive properties of D. carota subsp. carota, and evidenced the industrial potential of this plant

As plantas do género Daucus L. são desde há séculos usadas na medicina tradicional como tratamento para disenteria, disfunção renal, entre outros problemas, particularmente a espécie Daucus carota. No entanto estas propriedades são baseadas no conhecimento popular e não de estudos científicos, assim justifica-se a necessidade de se realizarem estudos sobre as propriedades bioactivas desta espécie, especialmente do taxon D. carota subsp. carota, que está amplamente distribuído em Portugal Neste trabalho utilizou-se óleo essencial e extratos enriquecidos em compostos fenólicos (extração com solução de metanol a 70% (v/v), metanol absoluto ou água), todos obtidos a partir das partes aéreas de D. carota subsp. carota. As propriedades bioativas estudadas foram as atividade antibacteriana, antifúngica, antioxidante, anti-inflamatória. Adicionalmente foi ainda avaliada a citotoxicidade do OE. A atividade antibacteriana do óleo essencial e do extrato de metanol 70% foi determinada contra várias bactérias patogénicas. O óleo essencial demonstrou uma atividade mais intensa que o extrato contra S. aureus, L. monocytogenes e B. subtilis (0.32 – 0.64 WL/mL contra 5-10 mg/mL). As bactérias E. coli e S. typhimurium foram resistentes à ação tanto do óleo essencial como do extrato. As propriedades antifúngicas das amostras foram avaliadas contra leveduras (Candida spp. e Cryptococcus neofomans), dermatófitos e Aspergillus spp. que são conhecidos com agentes causais de várias patologias tanto em humanos como em animais. A avaliação da concentração mínima inibitória (CMI) e da concentração mínima letal (CML) demonstrou que o óleo essencial de Daucus carota subsp. carota tem uma atividade significativa especialmente contra dermatófitos (0.32 – 0.64 WL/mL) e C. neoformans (0.16 WL/mL). Por sua vez o extrato de metanol 70% apenas demonstrou atividade significante contra dermatófitos (1.25 – 10 WL/mL). A inibição do tubo germinativo e o efeito em biofilme pré-formado de C. albicans sugere que o óleo essencial poderá ser um potencial interesse no tratamento da candidíase. As propriedades antioxidantes das amostras foram avaliadas recorrendo à sua capacidade de capturar radicas livres (ABTS) e poder antioxidante através do método ORAC. O teor em fenólicos totais foi determinado para os vários extratos fenólicos utilizado o método de Folin-Ciocalteau. O teor em fenólicos totais foi muito semelhante entre todas as amostras, indicando que os compostos fenólicos presentes na parte aérea de cenoura selvagem apresentam igual solubilidade em água e em metanol. Os resultados obtidos para os ensaios de ABTS e ORAC demonstram que os extratos fenólicos apresentam uma maior XXI atividade quando comparado com o óleo essencial, o que seria de esperar uma vez que os compostos fenólicos estão descritos como sendo mais antioxidantes que os terpenos e terpenóides. Antes da determinação das propriedades anti-inflamatórias, a capacidade do óleo essencial para capturar NO● foi avaliada usando o SNAP como dador de NO●. O óleo essencial não teve qualquer efeito na captura de NO● libertado pela ação do SNAP. A atividade anti-inflamatória do óleo essencial foi testada através da inibição da libertação de NO em macrófagos estimulados com LPS. Os resultados demonstram que o óleo essencial reduziu a produção de NO em 19.04% na concentração de 0.64 WL/mL sem demonstrar citotoxicidade para as células. De forma a avaliar a potencial aplicação do óleo essencial em humanos, o perfil de segurança foi determinado usando diferente linhas celulares (queratinócitos, células epiteliais alveolares, macrófagos e hepatócitos) que mimetizam as principais vias de administração assim como o local de metabolização no organismo (fígado). Os resultados demonstram que o óleo essencial é seguro em concentrações abaixo de 1.25 WL/mL. O presente estudo contribuiu para um melhor conhecimento sobre as propriedades bioativas de D. carota subsp. carota , bem como permitiu evidenciar o potencial industrial desta planta