Gene therapy-based strategies for glioblastoma towards chemosensitization : use of gemini surfactants as drug delivery systems

Abstract

O glioblastoma é o tipo de tumor cerebral mais comum e agressivo, caraterizando-se por alta capacidade proliferativa, elevados níveis de angiogénese e grande resistência à quimioterapia. O tratamento médico habitual envolve a remoção do tecido tumoral através de cirurgia, seguida de radioterapia com concomitante ou subsequente administração do agente alquilante temozolomida (TMZ). No entanto, a evolução clínica está longe de ser satisfatória, sendo a taxa de sobrevivência média dos doentes de apenas 15 meses após o diagnóstico. Tendo em consideração que a maior causa de insucesso do tratamento desta patologia reside na resistência intrínseca e adquirida aos fármacos, este trabalho teve por principal objectivo o desenvolvimento de estratégias terapêuticas capazes de sensibilizar as células de GBM a agentes quimioterapêuticos. Com este propósito, foram implementadas duas estratégias de terapia génica não-viral, envolvendo o uso de tensioativos gemini catiónicos (CGS) e explorando o seu potencial para a vectorização de ácidos nucleicos e fármacos. Numa das estratégias foram utilizados CGS como vectores de siRNAs em células humanas de glioblastoma (U87), a fim de diminuir a expressão da proteína anti-apoptótica survivina, sobre-expressa em tecidos tumorais, e aumentar, consequentemente, a susceptibilidade das células a agentes quimioterapêuticos. A segunda estratégia usufruiu da vantagem dos GSC promoverem a transferência de pDNA tanto para o núcleo como para as mitocôndrias de células de uma linha de glioblastoma estabelecida a partir de um tumor recorrente (DBTRG-05MG), e explorou a capacidade desses mesmos sistemas de entrega induzirem a libertação, em ambos os organelos, do fármaco anticancerígeno cisplatina (CDDP), cuja ação farmacológica envolve a formação de aductos com moléculas de DNA. Neste trabalho ficou patente que a redução da expressão de survivina potencia sinergisticamente a acção tóxica dos compostos TMZ e etopósido nas células U87. Por outro lado, a exposição de células DBTRG-05MG a CDDP incorporada em complexos de pDNA e tensioativos gemini derivados de serina conduziu a uma diminuição drástica da viabilidade e da proliferação das células, bem como à paragem do ciclo celular na fase S, efeitos que mostraram ser mais severos do que os induzidos por CDDP na forma livre, na mesma concentração. Adicionalmente, o pDNA usado como veículo de CDDP, complexado com tensioativos gemini, demonstrou não ter perdido a capacidade de promover expressão génica, quando transferido para o núcleo ou para a mitocôndria. Desta forma, as estratégias implementadas neste estudo revelaram a possibilidade de reduzir as doses terapêuticas de fármacos anticancerígenos, contribuindo para prevenir o desenvolvimento de quimiorresistência e obviar efeitos colaterais dos fármacos. Além disso, demonstrando a versatilidade e o elevado potencial das formulações contendo tensioativos gemini para a 5 vectorização de ácidos nucleicos e fármacos em células de GBM, este estudo abre caminho a abordagens terapêuticas multi-modais que, aliando a quimioterapia à terapia génica, permitem vencer com elevada eficiência a quimiorresistência de GBM

Glioblastoma (GBM) is the most common and aggressive primary brain tumor, being characterized by its propensity for proliferation, strong angiogenesis and resistance to chemotherapy. The standard treatment involves maximal surgical resection, radiotherapy and adjuvant or concomitant administration of the alkylating drug temozolomide (TMZ). However, the clinical outcome has proven to be far from being satisfactory, patients having a median survival of only 15 months after diagnosis. Taking into account that the major cause of treatment failure in GBM patients is the intrinsic and acquired drug resistance, the objective of the present work was centered in the development of therapeutic strategies aiming at sensitizing GBM cells to chemotherapeutics. To accomplish this objective, two gene therapy-based approaches were developed, involving the use of cationic gemini surfactants (CGS) and exploiting their potential for drug delivery. The first strategy took advantage of the ability of CGS to deliver siRNA, in order to promote downregulation of the anti-apoptotic protein survivin, aberrantly expressed in tumor tissues, so that GBM cells (U87) become more susceptible to chemotherapeutics. The second strategy benefited from the potential of GCS to deliver pDNA into nucleus and mitochondria in human recurrent glioblastoma cells (DBTRG-05MG), exploring their capacity to promote in both organelles a co-delivery of the anti-cancer drug cisplatin (CDDP), whose pharmacological activity is based on the formation of adducts with DNA molecules. Significant results were obtained showing that survivin knockdown combined with temozolomide or etoposide administration resulted in a synergistic toxic effect on U87 cells. Additionally, the delivery of CDDP formulated in serine-derived gemini surfactant-based complexes led to a drastic decrease of viability of DBTRG-05MG cells, an efficient inhibition of cell growth and a significant arrest of the cell cycle in the S phase, effects that showed to be much more severe than those induced by free CDDP, at the same concentrations. Moreover, it was observed that the pDNA, used as a vehicle of CDDP formulated in gemini surfactant-based complexes, did not lose its capacity to promote gene expression, when delivered both in the nucleus and in mitochondria. Therefore, both strategies implemented in this study revealed the possibility of reducing the doses of anti-cancer drugs to prevent the emergence of chemoresistance and drug side-effects. Additionally, benefiting from the versatility and potential of gemini surfactant-based formulations for drug delivery in GBM cells, this study opens windows towards the establishment of multimodal therapeutic approaches, allying chemotherapeutics to gene therapy, aiming at surpassing the chemoresistance of GBM.