Exosomes release by cardiomyocytes modulate angiogenic response in heart ischemia

Abstract

O coração é um orgão complexo formado por diversos tipos de células que dependem de uma rede de comunicação intercelular organizada que assegura diversas funções, incluindo, a manutenção da estrutura, a contração cardíaca e um eficaz bombeamento sanguíneo. A doença de isquémia cardíaca é fundamentalmente caracterizada pela redução do fornecimento sanguíneo ao miocárdio devido a obstrução de uma artéria coronária, causando deste modo um fornecimento insuficiente de nutrientes a determinadas áreas do músculo cardíaco. Devido à alta exigência metabólica do miocárdio, a carência em O2 e nutrientes poderá conduzir a profundas implicações na função cardíaca. Estudos recentes têm demostrado que as células endoteliais cardíacas apresentam um papel importante na sobrevivência e contração do miocárdio. Contudo, a maquinaria molecular que permite a comunicação intercelular entre cardiomiócitos e células endoteliais, via exossomas, no contexto de isquémia cardíaca, permanece em grande parte inexplorada. Assim, o principal objetivo deste estudo consistiu em caracterizar a comunicação estabelecida entre cardiomiócitos e células endoteliais, via exossomas, e compreender de que forma a isquémia poderá afetar esta interação no contexto de promoção de angiogénese. Os resultados obtidos neste estudo, usando diferentes abordagens, demostram que os exossomas secretados por cardiomiócitos, submetidos a isquémia, promovem a angiogénese de células endoteliais cardíacas. De facto, mostramos que exossomas isquémicos incubados em células endoteliais promovem a sua proliferação, migração, formação de tubos, sprouting e sprouts em anéis de aorta. Em suma, estes resultados sugerem fortemente que os exossomas isquémicos têm o potencial para promover a angiogénese no coração. Para validar os resultados obtidos in vitro, decidimos avaliar a formação de vasos usando a membrana corioalantóica da galinha ex vivo. Seguramente, os resultados obtidos com este ensaio mostram que os exossomas isquémicos promovem o crescimento de um maior número de vasos, reforçando a ideia de que os exossomas isquémicos comunicam com as células endoteliais a fim de manter a homeostase do coração. XX Para além disso, mostramos que os exossomas isquémicos induzem uma diminuição significativa na permeabilidade celular, sugerindo que a integridade das proteinas de junção das células endoteliais se encontram afetadas pelos exossomas. Em concordância com este resultado, observamos que os exossomas isquémicos induzem uma redistribuição da proteina ZO-1 na monocamada de células endoteliais, quando comparados com os exossomas controlo. Tendo em consideração os resultados obtidos no ensaio de permeabilidade celular, fomos avaliar o efeito destes exossomas libertados por cardiomiócitos na resistência elétrica transendotelial. Surpreedentemente, e contrariamente aos ensaios de permeabilidade, os valores da resistência eléctrica transendotelial diminuem na presença de exossomas isquémicos, quando comparados com os exossomas controlo. Todos estes resultados no seu conjunto sugerem que os exossomas têm a capacidade de afetar a permeabilidade e a resistência elétrica transendotelial. Em resumo, prevemos um modelo de comunicação entre cardiomiócitos e células endoteliais, via exossomas, com o objetivo de manter a homeostase cardíaca. Os resultados obtidos neste estudo fornecem novas evidências sobre a rede de comunicação estabelecida entre cardiomiócitos e células endoteliais, o que poderá vir a contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias destinadas a preservar a função cardíaca na doença de isquémia

The heart is a complex organ formed by a diversity of cell types that depends on a wellregulated intercellular communication network to perform its functions, namely to provide structure, ensure regulated heart contraction, and efficient pumping of blood. Ischemic heart disease (IHD) is primarily associated with the reduction of myocardial blood supply, mainly as a result of the obstruction of a coronary artery causing a defective nourishment of certain areas of the heart muscle. Given the high metabolic demand of the myocardium, the lack of O2 and nutrients in the sequence of artery occlusion can have profound effects on heart function. Recent studies have demonstrated that endothelial cells (ECs) play a critical role in supporting cardiomyocytes survival and myocardial contraction. However, the molecular machinery underlying the intercellular communication between cardiomyocytes and ECs, via exosomes, namely in the context of ischemia, remain largely underexplored. Therefore, the main objective of this study is to characterize the communication established between cardiomyocytes and ECs, through exosomes, and determine how ischemia can affect this interplay, within the context of angiogenesis promotion. The results presented in this study, using different complementary approaches, demonstrate that exosomes released by cardiomyocytes, subjected to ischemia, stimulate angiogenesis of cardiac ECs. Indeed, we show that ischemic exosomes incubated with EC present an ability to promote proliferation, migration, tube formation, angiogenic sprouts and aortic ring sprouts. These results suggest that ischemic exosomes may play a proangiogenic effect in the heart. To confirm these data, we decided to validate the results obtained in vitro in a more physiological and relevant biological model, using in vivo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay. This assay confirms and validate the previous studies in vitro, suggesting that ischemic exosomes derived from cardiomyocytes communicate with ECs in order to maintain heart homeostasis. Moreover, we showed that ischemic exosomes induce a significant decrease in cellular permeability, suggesting that the integrity of ECs junction’s proteins is being affected by exosomes. In agreement, we demonstrate that ischemic exosomes induce a redistribution of ZO-1 on the endothelial cell monolayer, when compared with control exosomes. XXII Considering the results obtained in the cellular permeability assay, we also evaluated the effect of these exosomes released by cardiomyocytes on the transendothelial electrical resistance (TEER). Surprisingly, and contrary to the permeability assays, the TEER values decreased in the presence of ischemic exosomes, in comparison with control exosomes. Together, these results suggest that exosomes differentially affect permeability and TEER. In conclusion, we envision a model whereby cardiomyocytes and endothelial cells communicate via exosomes to maintain cardiac homeostasis. Altogether, this study provides new evidence regarding the communication network established between cardiomyocytes and endothelial cells, which may contribute for the development of new strategies that aim to preserve cardiac function in ischemic heart disease