Intra-axonal translation of beta-actin mRNA underlies presynaptic differentiation

Abstract

As sinapses são a principal unidade do sistema nervoso. A sua formação resulta do contacto entre duas estruturas bem organizadas, os terminais pré- e pós-sinápticos. A formação do terminal pré-sináptico envolve a acumulação de material pré-sináptico no local de contacto, e depende de inúmeros eventos interrelacionados, os quais não são ainda bem conhecidos. Assim, é de extrema importância estudar os mecanismos intracelulares que coordenam a diferenciação das sinapses. A tradução local do mARN é um mecanismo que regula processos neuronais. Os sinais extracelulares que chegam à célula activam a tradução de mARNs no axónio, originando novas proteínas neste compartimento celular. Consequentemente, estas proteínas participam em vários processos no desenvolvimento do axónio, favorecendo assim o comportamento autónomo do mesmo. A restrição na localização de mARNs é feita através de complexos macromoleculares que direccionam os transcritos desde o núcleo para as zonas distais do axónio. A coordenação temporal e espacial da tradução de mARNs confere aos axónios a extraordinária capacidade de se adaptar a circunstâncias distintas. A síntese local de proteínas nos axónios tem sido intensamente estudada durante os processos de crescimento, condução e sobrevivência axonal. Neste trabalho observámos que a tradução intra-axonal de mARNs regula a formação do terminal pré-sináptico. Inicialmente, observámos que mecanismos de tradução são ativados em axónios isolados em resposta a moléculas sinápticas, como o FGF-22. Em seguida, verificámos que a acumulação de material pré-sináptico, induzida por FGF-22 ou esferas revestidas com polímeros de lisina, depende da tradução local de mARNs. Assim, este primeiro conjunto de resultados, demonstra que a diferenciação pré-sináptica depende da síntese local de proteínas em axónios. Muitos estudos têm demonstrado que a organização do citoesqueleto regula a formação de novos terminais pré-sinápticos. Observámos que, após um estímulo sinaptogénico, a polimerização de actina aumenta nos axónios e que este processo é igualmente dependente de síntese local de proteínas. Isto mostra que os mecanismos de tradução de mARN estão envolvidos no desenvolvimento sináptico. O axónio contém milhares de mARNs. O mARN da β-actina foi um dos primeiros transcritos encontrados em zonas distais e cones de crescimento axonais. Através de microscopia em células vivas, demonstrámos que um repórter de β-actina, é expresso em axónios após o estímulo sinaptogénico. Estes resultados indicam que o mARN da β-actina xiii é um importante regulador da formação do terminal pré-sináptico. Com o objetivo de compreender o papel da β-actina na formação sináptica usámos este mesmo repórter para bloquear o transporte anterógrado do mARN β-actina. A ausência do mARN da β-actina nos axónios levou à inibição da formação de novos locais pré-sinápticos e à polimerização de actina. Fizémos também bloqueio da tradução através de siRNA (do inglês small interfering RNA), após o que verificámos defeitos na formação do terminal pré-sináptico. Este conjunto de resultados evidencia que a localização e tradução do transcrito para a β- actina é um pré-requisito para a formação pré-sináptica. Neste trabalho foram ainda desenvolvidas co-culturas entre neurónios e células musculares, com o intuito de estudar a importância da β-actina durante a formação da junção neuromuscular. Desta forma, verificámos que a junção neuromuscular foi negativamente afectada após o bloqueio do transporte do mRNA da β-actina para os axónios, o que demonstra a importância desta proteína durante o estabelecimento de novas sinapses. Em conclusão, o nosso estudo permitiu identificar um novo mecanismo regulatório da diferenciação pré-sináptica. Além disso, demonstrámos que o mARN da β- actina constitui um importante interveniente deste processo axonal, e identificámos um novo papel desta proteína durante o desenvolvimento do axónio.

Synapses are the principal unit of the nervous system. Synapse formation relies on the proper establishment of contacts between the pre- and the postsynaptic side. Presynaptic differentiation involves accumulation of presynaptic material at the contact site. Moreover, it depends on multiple interrelated steps, which are not entirely understood. As such, studying the intracellular mechanisms that govern synaptic differentiation is of utmost importance to better solve the glitches of the nervous system. Axonal mRNA translation is a mechanism that allows local control of neuronal events. The autonomous axonal behavior is highly dependent on local protein synthesis since, depending on external cues axons respond by activating translation of specific mRNAs. Therefore, newly synthesized proteins participate in the molecular events required for axonal development. To be spatial restricted, mRNAs are transported from the nucleus to distal axons into molecular complexes that regulate the exact location of transcripts. The spatial and temporal regulation of mRNA translation confers axons an amazing capacity to adapt to distinct environments. Local protein synthesis has been intensively studied during axon outgrowth, guidance and survival. In this work, we showed that local mRNA translation modulates presynaptic differentiation. We also observed that a synaptogenic factor, such as FGF-22, can activate translation mechanisms in isolated axons. In addition we observed that both FGF-22 and PDL-coated beads induce an increase of presynaptic clusters, a process dependent on local mRNA translation. Thus, axonal translation is required for presynaptic differentiation. It is well-known that the rearrangement of the actin cytoskeleton supports the formation of newly presynaptic boutons. Interestingly, we observed that actin polymerization increases during FGF-22/bead-induced presynaptic differentiation. This event also required local protein synthesis, indicating that local mRNA mechanism underlies synaptic development. Thousands of mRNAs are localized to axons. One of the first transcripts found in distal axons and growth cones was β-actin mRNA. Using live image approaches, we observed that a β-actin reporter is locally synthesized upon stimulation with FGF-22, indicating that the β-actin mRNA might act as a strong intervenient in presynaptic formation. To addressed this question we blocked the transport of endogenous β-actin mRNA to distal axons. This blockade prevented formation of new presynaptic clusters and xv F-actin polymerization. In addition, we specifically down-regulated the axonal translation of β-actin mRNA using a siRNA approach. We observed defects in FGF-22-induced synaptic differentiation. Accordingly, we demonstrated that the localization and translation of β-actin mRNA is required to form presynaptic clusters. In order to understand the role of local β-actin transcript during NMJ formation in vitro, we developed a novel neuron-muscle co-culture. Our results demonstrate that the mislocalization of the β-actin mRNA blocks the formation of neuromuscular junctions. Hence, axonal β-actin is required for the establishment of new synapses. In conclusion, this study determines a novel mechanism required for presynaptic differentiation. Also, we dissected a new role for β-actin transcript during axonal development, which supports the hypothesis that the β-actin mRNA plays an important role in modulating axonal differentiation.