Envelhecimento muscular esquelético e alterações mitocondriais com a idade : o papel do sedentarismo e dos estilos de vida activa ao longo da vida

Abstract

O processo de envelhecimento biológico caracteriza-se por uma progressiva deterioração fisiológica com redução na capacidade funcional e aumento na incidência e susceptibilidade a determinadas doenças. A sarcopenia associada ao envelhecimento, caracterizada por uma redução da massa e força muscular com a idade é considerada uma característica major ao nível do envelhecimento do tecido muscular esquelético, sendo responsável por uma diminuição dramática na capacidade funcional dos idosos com consequente perda de independência e mobilidade. Várias teorias têm sido descritas com o objectivo de tentar explicar o fenómeno de envelhecimento. Neste contexto, a teoria do envelhecimento mitocondrial tem sido uma das mais prevalentes, relacionando o envelhecimento com a disfunção mitocondrial e o stress oxidativo. O aumento no stress oxidativo e consequente lesão oxidativa das biomoléculas, associado ao envelhecimento, será o resultado de uma maior produção de ERO mitocondrial e/ou uma diminuição nas defesas antioxidantes que associados a uma maior susceptibilidade dos tecidos à lesão oxidativa poderão ter consequências ao nível da diminuição na funcionalidade celular. Neste sentido, evidências recentes sugerem que muitas das alterações biológicas associadas ao processo de envelhecimento podem ser atenuadas pela adopção de estilos de vida activa e saudáveis, nomeadamente ao nível da prática regular de exercício físico. Com este projeto pretendemos estudar as alterações estruturais do músculo esquelético associadas à idade. Adicionalmente é também nosso objectivo estudar mitocôndrias isoladas a partir do músculo esquelético, considerando as suas características morfológicas, bioquímicas e funcionais e verificar qual o papel que o sedentarismo e diferentes padrões de exercício físico realizado ao longo da vida poderão ter nas variáveis em estudo. Mais especificamente, pretendemos caracterizar o tecido muscular esquelético e as mitocôndrias isoladas a partir de 6 músculos esqueléticos de jovens, idosos sedentários e idosos activos. Com vista a atingir esses objectivos, usaremos 60 ratinhos machos C57BL/6J, com 3 meses de idade, posteriormente divididos em 4 grupos (grupo jovem- GJ; grupo velhos sedentários- GVS; grupo velhos activos- GVA; grupo velhos treinados- GVT). Os animais do GJ serão sacrificados logo após uma semana de quarentena no nosso laboratório, com 3 meses de idade. Os animais do GVS serão colocados individualmente em gaiolas pequenas; os animais do GVA serão colocados individualmente em gaiolas com livre acesso a uma roda de actividade durante todo o protocolo experimental e os animais do GVT serão submetidos a um protocolo de exercício de resistência em tapete rolante. A actividade física voluntária será monitorizada diariamente nos animais do GVA ao longo de todo o período experimental (20 meses). Todos os animais serão mantidos a temperatura constante (21-25ºC) num ciclo diário de 12 horas dia-noite, com comida e bebida ad libitum. Após este período, os animais dos grupos GVS, GVA e GVT serão sacrificados (com 23 meses de idade) por deslocamento cervical e os músculos dos membros posteriores (soleus, gastrocnemius, tibialis anterior, e quadriceps) serão extraídos para análise morfológica e para o isolamento mitocondrial. A avaliação morfológica do musculo esquelético será realizada de acordo com métodos previamente descritos [1]. O isolamento das mitocôndrias musculares esqueléticas será realizado de acordo com métodos já descritos por Tonkonogi e Sahlin [2]. Da suspensão final de mitocôndrias serão separadas aliquotas de modo a proceder às análises funcional, bioquímica e morfológica. Para a avaliação da funcionalidade mitocondrial iremos recorrer à utilização de um eléctrodo de oxigénio (Hansatech DW 1, Norfork,UK). Os ensaios da actividade respiratória mitocondrial consistirão na avaliação de determinados parâmetros respiratórios mitocondriais, nomeadamente, o estado 3, estado 4, RCR (um indicador de integridade mitocondrial) e o ADP/O (indicador de eficiência fosforilativa mitocondrial). Com vista a avaliar a permeabilidade da membrana interna e a taxa máxima de fosforilação 7 oxidativa em condições de desacoplamento, adicionaremos, durante o estado 3 da respiração mitocondrial, oligomicina e carbonil cianide m-clorofenilhidrazone (CCCP), respectivamente. Os dados da funcionalidade serão expressos em actividade respiratória/mg proteina mitocondrial e actividade respiratória/actividade CS. Considerando as análises bioquímicas, serão avaliados marcadores de stress oxidativo (GSH/GSSG, grupos-SH, aconitase), defesas antioxidantes (actividades da GSH, SOD e GPx), marcadores de lesão oxidativa (grupos carbonilo) e um marcador de actividade metabólica (actividade da citrato sintase). A avaliação morfológica e morfométrica das mitocôndrias será realizada por microscopia electrónica de transmissão usando métodos convencionais de modo a caracterizar quantitativamente e qualitativamente a suspensão mitocondrial. A análise estatística será efectuada com recurso à utilização de testes paramétricos ou não-paramétricos de acordo com o tipo de distribuição das variáveis dependentes. Para além da determinação de diferenças entre grupos serão realizadas igualmente correlações entre as variáveis dependentes e independentes.

Biological aging is characterized by a progressive decline of physiological function leading to a general impairment in functional capacity and increased susceptibility to disease. Agerelated sarcopenia, characterized by a reduction in muscle mass and strength is considered one of the most striking features of aging at the level of the skeletal muscle. Age-related morphological alterations in skeletal muscle can be considered as one of the mechanisms responsible for muscle weakness in the aged population. Several theories have been postulated in an attempt to explain the foundations of biological aging. The mitochondrial theory of aging is one of the most prevalent in this field. This theory postulates that aging results from the progressive accumulation of oxidative damage and impairment of cellular function relating several factors, namely mitochondrial dysfunction and oxidative stress. The age-related increases in oxidative stress levels and oxidative damage to biomolecules will be the result of an increased production of reactive oxygen species or diminished antioxidant defenses, or both, together with an increased susceptibility to oxidative damage, ultimately leading to diminished cellular function. Recent evidences suggest that healthy and active lifestyles, namely with the practice of regular physical exercise could be an essential tool to counteract the adverse effects of aging. The objective of the present project is to study the age-related structural alterations at the level of the skeletal muscle. Additionally, we intend also to characterize the effects of chronological age on skeletal muscle mitochondria, in terms of its morphological, biochemical and functional status and to verify the impact of sedentarism and different patterns of physical exercise in the observed alterations. In particular, we intend to characterize the skeletal muscle and mitochondria from young, aged and lifelong exercised aged skeletal muscle. In order to achieve these objectives we will use 60 C57BL/6J strain male mice, aged 3 months, further divided into 4 groups (young group- YG; sedentary old 9 group- SOG, voluntary activity old group- VAOG; and exercise trained old group- ETOG). Animals from YG will be sacrificed immediately at 3 months old. Animals from SOG group will be individually confined to small cages, animals from VAOG will be individually placed into cages with free access to a rodent wheel during the whole period of the experimental protocol and, animals from ETOG will be submitted to a treadmill exercise endurance training protocol. Voluntary physical activity will be assessed during the whole period of the experiment in the VAOG group (20 months). All animals will be kept at constant temperature (21–25°C) on a daily light schedule of 12 h of light vs. dark, provided with food and water ad libitum. After this period SOG, VAOG and ETOG animals will be sacrificed (aged 23 months) by cervical dislocation and hindlimb muscles (soleus, gastrocnemius, tibialis anterior, and quadriceps) will be extracted for morphological analysis and preparation of isolated mitochondria. Skeletal muscle morphological analysis will be performed as previously described [1]. Skeletal muscle mitochondria will be prepared as previously described by Tonkonogi and Sahlin [2]. From the final mitochondrial suspension aliquots will be separated for functional, biochemical and morphological analysis. Mitochondrial respiratory function will be measured using a polarographically Clark-type oxygen electrode (Hansatech DW 1, Norfork, UK). The measures will consist in some of the standard respiratory parameters that include state 3 respiration; state 4 respiration; RCR (a measure of the dependence of the respiratory rate on ATP synthesis) and ADP/O (a measure of mitochondrial oxidative phosphorylation efficiency). To quantify mitochondrial inner membrane permeability and the maximal rate of uncoupled oxidative phosphorylation, oligomycin and carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP), respectively, will be added during state 3 respiration with saturated amounts of ADP. Data will be presented as respiratory activity/mg mitochondrial protein and respiratory activity/CS activity. Regarding the biochemical analysis, oxidative stress markers (GSH/GSSG, sulfhydryl protein groups 10 (SH), aconitase), antioxidant levels (GSH, SOD, and GPx activities), oxidative damage markers (protein carbonyl derivatives) and a metabolic activity marker (citrate synthase activitiy) will be assessed. Morphologic and morphometric mitochondrial evaluation will be assessed by transmission electron microscopy using conventional methods in order to perform a qualitative and quantitative characterization of the mitochondrial suspensions. Statistical analysis will be performed using parametric or non-parametric tests according to the distribution of the dependent variables. In addition to the analysis of the differences between groups, the correlations between dependent and independent variables will be performed as well.