Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/28824
Title: Prothrombotic status in Myeloproliferative neoplasms : the role of JAK2V617F allele burden and platelets/leukocytes activation
Authors: Coucelo, Margarida Carreira Revez Pereira 
Orientador: Ribeiro, Maria Letícia
Issue Date: 2010
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: As neoplasias mieloproliferativas (MPN) são doenças da “stem-cell” hematopoiética e que estão associadas à ocorrência de eventos trombohemorragicos. Diferentes estudos sugerem que doentes com Policitémia Vera (PV) e Trombocitémia Essencial (ET) apresentam um estado protrombótico e que este poderá estar relacionado não só com a activação constitutiva da via JAK/STAT mas também com a carga alélica da mutação JAK2V617F. Objectivo: Investigar a presença de marcadores de activação hemostática e a relação destes com a carga alélica JAK2V617F e trombose. Métodos: Foram estudados 28 PV, 47 ET e 48 controlos saudáveis. Os doentes estão clinicamente estáveis e sob tratamento com Hidroxiureia; tempo de seguimento de 78 meses nas PV e de 84 meses nas ET. Sete doentes com PV e 16 com ET apresentaram história de trombose ao diagnóstico. Após consentimento informado, os doentes suspenderam a aspirina nos 10 dias prévios ao estudo. Por citometria de fluxo (FACSCalibur, BD) avaliou-se: expressão de P-selectina (CD62P) e granulofisina (CD63) plaquetar, basal e após estímulo com agonistas; capacidade de captação e libertação de mepacrina nas plaquetas; agregados plaqueta-leucócito; expressão de CD11b nos leucócitos e de factor tecidular (TF) nos monócitos, basal e após estímulo com LPS. A pesquisa da mutação JAK2V617F foi efectuada por PCR alelo específica e a quantificação por PCR em Tempo Real (JAK2 MutaQuant, Ipsogen). O screening de mutações no exão 10 do gene MPL, foi efectuado por SSCP e as mutações identificadas por sequenciação (ABI 310 Genetic Analyzer, AB). Resultados: A mutação JAK2V617F foi encontrada em 28 PV (100%) e 28 ET (60%); 2 doentes com ET, apresentam mutações no exão 10 do gene MPL: W515L e R524C. Os doentes apresentam um aumento significativo de expressão basal de CD62P e de CD63 e de resposta ao ácido araquidónico; em todos os doentes a resposta ao TRAP6 está significativamente diminuída; 77% das PV e 50% das ET apresentam um fenótipode “storage pool disease”. Todos os doentes apresentam um aumento significativo de expressão basal de CD11b nos leucócitos e de TF nos monócitos. Os agregados plaqueta-leucócito estão significativamente aumentados em todos os doentes, sendo que os agregados plaqueta-neutrófilo (PMN) estão significativamente aumentados nas ET vs PV. Os doentes com carga alélica JAK2V617F>50% apresentam um aumento significativo na expressão de CD11b nos leucócitos e de agregados plaqueta-PMN, em comparação com os doentes com carga alélica <50%; as PV com carga alélica >50% apresentam um aumento estatisticamente significativo de TF nos monócitos. Nas ET, foi encontrada uma correlação estatisticamente significativa entre trombose e a presença de mutações JAK2V617F ou MPL, e entre trombose e carga alélica>50%. Esta associação não foi encontrada nas PV. A relação entre carga alélica e alterações plaquetares é difícil de estabelecer, uma vez que não foram encontradas alterações estatisticamente significativas. Discussão: Os dados apresentados mostram, com significado estatístico, que os doentes com PV e ET apresentam plaquetas e leucócitos activados e um aumento de agregados plaqueta-leucócito em circulação. Os doentes com carga alélica>50% apresentam marcadores de activação significativamente aumentados em comparação com os doentes com carga alélica <50%, consistente com a influência da carga alélica e perda de heterozigotia para a mutação JAK2V617F na activação celular. Nas ET a presença da mutação e a carga alélica >50% está significativamente associada a eventos trombóticos ao diagnóstico. Conclusão: Uma vez que as tromboses representam, nos doentes com MPN, uma das principais causas de co-morbilidade, foram investigados marcadores de activação da hemostase e a sua relação com a carga alélica JAK2V617F. Os resultados apresentados ilustram diferentes mecanismos que favorecem a trombose nas PV e ET, nomeadamente, activação basal das plaquetas, monócitos e PMN, aumento de FT nos monócitos e de aumento de agregados plaqueta-leucócito em circulação.
Introduction: Myeloproliferative neoplasms (MPN) are stem cell-derived proliferative diseases associated with thrombohemorragic diathesis. Different studies suggested that Polycythemia Vera (PV) and Essential Thrombocythemia (ET) patients have a baseline protrombotic status, which could be related to constitutive JAK2/STAT signalization in correlation with JAK2V617F mutation allele burden. Objective: Investigate the baseline hemostatic activation markers and their correlation with the JAK2V617F allele burden and thrombosis. Methods: 28 PV and 47 ET patients and a control group of 48 healthy volunteers were studied. All the patients are under hydroxyurea treatment and remain clinically stable with follow up periods of 78 months for PV and 84 months for ET. Seven PV and 16 ET patients have a history of thrombosis at diagnosis. With patients’ written informed consent, aspirin was withdrawn for 10 days prior the studies. Using flow cytometry (FACSCalibur, BD), we evaluated: platelet P-selectin (CD62P) and granulophysin (CD63), at baseline and after stimulation with agonists; platelet uptake and release of mepacrine; platelet-leukocyte aggregates, leukocyte CD11b and monocyte Tissue factor (TF) at baseline and after stimulation with LPS. JAK2V617F allele was detected by Allele specific PCR and quantified by Allele specific Real Time PCR (JAK2 MutaQuant, Ipsogen). MPL exon 10 mutations were screened by SSCP and identified by direct sequencing (ABI 310 Genetic Analyzer, Applied Biosystems). Results: JAK2V617F mutation was found in 28 PV patients (100%) and in 28 ET patients (60%). In two other ET patients we found MPL gene exon 10 mutations: W515L and R524C. All patients have, at baseline, a significant increased expression of CD62P and CD63, and a significant increase response to arachidonic acid and diminished levels of CD62P and CD63 following TRAP6 activation. A phenotype of storage pool disease was found in 77% of PV and 50% of ET patients. At baseline all patients have activated leukocytes with a statistically significant increase in CD11bexpression and monocyte-TF. The latter was significantly elevated in PV vs ET patients. Circulating platelet-leukocytes aggregates were significant higher in all patients; in the ET, platelet-PMN aggregates were significantly increased vs PV patients. Patients with JAK2V617F>50%, have a statistically significant increase in leukocytes CD11b expression and in platelet PMN-aggregates, in comparison with those with JAK2V617F<50%;PV patients with allele burden >50% have a statistically significant increase in monocytes-TF. In ET patients we found a statistically significant correlation between thrombosis and JAK2 or MPL mutations, furthermore, ET patients with JAK2V617F allele burden >50% have statistically higher incidence of thrombosis. No such correlation in PV patients. Regarding to platelets activation, it’s not evident such effect since no significantly differences were found. Discussion: These data shown, with statistically significance that PV and ET patients have circulating activated platelets and leukocytes, and increased number of plateletleukocyte aggregates. Consistent with the influence of allele burden and acquisition of loss of heterozygosity for the JAK2V617F mutation in leukocyte activation, all patients with allele burden >50% presented significantly increased activation markers comparing to patients with allele burden >50%. In ET patients the presence of JAK2V617F mutation and allele burden>50% was significantly associated with a previous history of thrombosis. Conclusion: As thrombosis is one of the main co-morbilities in MPN patients, we investigated the baseline hemostatic activation markers and their correlation with the JAK2V617F allele burden. These data clearly illustrate several mechanisms favoring thrombosis in PV and ET patients, namely, the baseline activation of platelets, monocytes and PMNs leukocytes, increased monocyte-TF and platelet-leukocytes aggregates.
Description: Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/28824
Rights: openAccess
Appears in Collections:FCTUC Ciências da Vida - Teses de Mestrado

Files in This Item:
File Description SizeFormat
TESE MARGARIDA COUCELO.pdf724.57 kBAdobe PDFView/Open
Show full item record

Page view(s)

97
checked on Jul 8, 2020

Download(s)

22
checked on Jul 8, 2020

Google ScholarTM

Check


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.