Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/28823
Title: A multifactorial approach to the biological role of the mycobacterial maltokinase
Authors: Tiago, Ana Branco Maranha 
Orientador: Empadinhas, Nuno
Keywords: Maltocinase; Maltose-1-fosfato; Micobactéria; Metabolismo; RT-PCR
Issue Date: 2010
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: Há cerca de vinte anos pensava-se que a tuberculose era uma doença em vias de erradicação no entanto, hoje em dia, é uma das doenças mais mortíferas do mundo. A Organização Mundial de Saúde estima que mais de um terço da população mundial esteja infectada com tuberculose. A maltocinase (Mak) é uma enzima essencial para o crescimento micobacteriano que se encontra presente na maioria dos genomas micobacterianos anotados. Contudo, o papel fisiológico desta enzima ainda não é totalmente conhecido. Numa tentativa de elucidar o papel desempenhado pela Mak na fisiologia micobacteriana foram, neste trabalho, exploradas funções adicionais da proteína, in vitro. Foram testados substratos alternativos (aceitadores de grupo fosforil), bem como a possibilidade de a enzima estar envolvida na inactivação de antibióticos aminoglicosídeos. Foi ainda realizado um ensaio preliminar para análise das respostas transcripcionais do gene correspondente em M. smegmatis, em diferentes condições nutricionais. Simultaneamente, para confirmar o papel essencial proposto para a Mak, o organismo M. marinum foi seleccionado, como ferramenta para construção de um mutante knock-out condicional para mak, para deste modo avaliar os efeitos do silenciamento do gene no fenótipo do mutante. A proteína recombinante, com cauda de histidinas, foi purificada com vista a serem efectuados testes de especificidade de substratos. O protocolo de purificação foi modificado, através da alteração do pH do tampão fosfato de sódio, de modo a encurtar a duração da purificação. Em seguida, vários substratos foram testados comoaceitadores de grupos fosforil, nomeadamente antibióticos aminoglicosídeos, dissacarídeos e trissacarídeos. No entanto, não foi detectada qualquer actividade, excepto para a maltose, o que implica que em M. smegmatis o papel de aceitador de grupos fosfatos deve ser específico para este açúcar. É pois extremamente improvável que a proteína Mak confira resistência a aminoglicosídeos. Para avaliar a relação entre a expressão do gene mak de M. smegmatis e diferentes fontes de carbono no meio de cultura, determinámos a actividade da enzima em extractos celulares de M. smegmatis. Os resultados indicam que a actividade da Mak é significativamente afectada pela presença de maltose no meio. Com o objectivo de analisar as respostas trascripcionais do gene mak em diferentes condições nutricionais uma experiência de RT-PCR foi optimizada. No entanto, devido a uma série de problemas de ordem técnica e limitações a nível temporal, não foi possível progredir para além do que é apresentado neste trabalho. O desenho e construção para a criação do mutante condicional para a mak apresentado neste trabalho vão permitir, futuramente, a expressão condicional de genes essenciais ao crescimento micobacteriano, permitindo deste modo um melhor entendimento do seu envolvimento no metabolismo destas bactérias.
Twenty years ago Human tuberculosis (TB) was thought to be a disease on the verge of eradication. Nowadays TB is one of the deadliest diseases in the world and the WHO estimates that more than one-third of the world’s population is infected with TB. Maltokinase (Mak) is an enzyme essential for mycobacterial growth that is present in nearly all mycobacterial genomes. Nonetheless the physiological role of this enzyme remains to be fully elucidated. In an effort towards unveiling the role of Mak in mycobacterial physiology additional functions of the enzyme in vitro were explored, namely by testing possible alternative substrates (phosphoryl acceptors) as well as the possibility of the involvement of this enzyme in the inactivation of aminoglycoside antibiotics. A preliminary analysis of the transcriptional responses of the corresponding gene in M. smegmatis, in different nutritional conditions, was attempted. Concurrently, to confirm the proposed essentiality of Mak, M. marinum was selected as the tool for the construction of a mak conditional knock-out mutant, and thus, evaluate the effects of silencing the gene on the mutant’s phenotype. Recombinant His-tagged Mak was purified to further test substrate specificity. The purification protocol was made less laborious by the modification of the sodium phosphate buffer pH. Subsequently several substrates were tested as phosphoryl group acceptors Namely aminoglycoside antibiotics, disaccharides and trisaccharides, however no activity was detected, except for maltose, implicating that in M. smegmatisthe role of phosphate acceptor might be specific to maltose. It is then extremely unlikely the protein could render aminoglycoside resistance to bacteria. To evaluate the relation between mak expression and the nutritional source in the growth medium the activity of the enzyme was determined in M. smegmatis cell-free extracts. The results indicate that Mak activity is significantly affected by the presence of maltose in the medium. In order to analyze the transcriptional responses of the mak gene in different nutritional conditions an RT-PCR experiment was optimized but due to technical problems and time constraints, no further progress could be made beyond this stage. The design and construction for the engineering of the mak conditional mutant done in this work will, in the future, allow the conditional expression of genes essential for mycobacterial growth and in doing so, provide a better understanding of their involvement in mycobacterial metabolism.
Description: Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/28823
Rights: openAccess
Appears in Collections:FCTUC Ciências da Vida - Teses de Mestrado

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