Cellular effects and signalling pathways induced by MLK3 mutations

Abstract

A proteína mixed-lineage kinase 3 (MLK3) é uma cinase de serina/treonina vastamente expressa que está envolvida em diferentes funções fisiológicas como proliferação, apoptose, sobrevivência e migração celular. Ao responder a mitogénios e estímulos de stress regula a sinalização das MAPK através da activação das vias da ERK, JNK e p38. O seu domínio cinase é crucial para fosforilar e consequentemente activar moléculas alvo. Contudo, a activação da MLK3 nem sempre é requerida para a modulação de algumas funções por ela induzidas. A MLK3 pode ainda funcionar como proteína scaffold, ligando diferentes vias de sinalização. Mutações na MLK3 foram descritas, pela primeira vez, em 2010 pelo nosso grupo. Nesse mesmo trabalho, foi demonstrado que mutações missense na MLK3 possuíam potencial transformante e tumorigénico. Duas dessas mutações (P252H e R799C) mostraram um comportamento invasivo. Tendo em conta estas informações nós estabelecemos linhas celulares (HEK293) que expressam de uma forma estável estas mutações para assim identificar os efeitos celulares a elas associados e avaliar quais os alvos moleculares dependentes desses dois mutantes da MLK3. Verificámos que a mutação no domínio cinase da MLK3 (P252H) confere propriedades diferentes quando comparada com a mutação localizada no domínio rico em prolina. A mutação P252H parece induzir uma maior migração celular, enquanto a mutação R799C parece interferir com a diferenciação celular. Além disso, nós verificámos que ambas as mutações regulam a via do WNT de maneira distinta, seja através da activação da via canónica ou da não canónica. Em resumo, o trabalho descrito nesta tese mostra que duas das mutações na MLK3, previamente descritas, interferem com vias de sinalização cruciais do desenvolvimento colorectal e neste sentido contribuem para a tumorigénese colorectal.

Mixed-lineage kinase 3 (MLK3) is a serine/threonine kinase widely expressed and involved in different physiological functions, such as proliferation, apoptosis, cell survival and cell migration. Responding to mitogens and stress stimuli it regulates MAPK signalling through activation of ERK, JNK, p38 pathways. Its kinase domain is crucial to phosphorylate and thus activate downstream targets. However, MLK3 activation is not always required to MLK3-induced modulation of some cellular functions. MLK3 may indeed function as a scaffold protein, linking different signalling pathways. MLK3 mutations were reported, for the first time, in 2010 by our group. Missense MLK3 mutations were found to be able to harbour transforming and tumourigenic potential. Two of the mutations (P252H and R799C) were found to show an invasive behaviour. Taking this data into account we generated HEK293 stable cell lines harbouring these mutations in order to identify associated cellular effects and evaluate which molecular targets were dependent of these two MLK3 mutants. We found that a mutation in MLK3 kinase domain (P252H) confers different properties when compared to a one localized in the proline-rich domain. P252H mutation seems to induce increased cell migration, while R799C seems to interfere with cell differentiation. Furthermore, we verified that both mutations regulate the WNT pathway in distinct manner, either through the activation of the canonical or non-canonical pathway. In summary, we showed that two of the MLK3 mutations previously described interfere with crucial pathways of colorectal development and in this way contribute to colorectal tumourigenesis.