Role of local protein synthesis in FGF22-induced presynaptic differentiation

Abstract

Neurons are highly complex and polarized cells with an incredible network of functionally active processes that extend outwards the cell body. Communication between neurons occurs at a specialized structure, the synapse, frequently distant from the soma, the neuron trophic center. For long, proteins were thought to be synthesized in the cell body and then guided by microtubule-mediated transport to specific sites in dendrites and axons. However, this model has been challenged by accumulating evidences suggesting local translation of specific mRNAs selectively localized to neurites. Local protein synthesis in axons has not been object of intense studies in the past and its functional significance is not clear. It is believed to be essential for several neurodevelopmental events like axonal guidance, synapse formation, synaptic plasticity, axonal regeneration and retrograde signaling. However, the involved mechanisms are far from being understood. In the present work we investigated the potential role of axonal translation in presynaptogenesis, the mechanism by which a functional presynaptic terminal is formed. During presynaptic differentiation, freely moving packets containing presynaptic material such as synaptic vesicles, vesicular and fusion proteins, recycling machinery and active zone components, accumulate at pre-defined sites along the axon shaft. Despite this, transition of nascent synapses to mature synapses also involves correct alignment between pre- and postsynaptic terminals, presynaptic growth and cytoskeletal restructuring. Lately, the required action of presynaptic organizing molecules, such as synaptic cell adhesion molecules (SynCAMs), fibroblast growthfactor-22 (FGF22), neuroligins, WNTs and thrombospondins, has been highlighted by several studies. In this work we focus our attention on FGF22-induced presynaptic differentiation, a target-derived soluble molecule recently proven to promote synaptic vesicles clustering in central nervous system (CNS) synapses. This work comprises two distinct parts. Firstly, we stimulated primary cultures of rat embryo hippocampal neurons with recombinant human FGF22; assessment of synapsin clustering demonstrated an increase in both number and size of presynaptic sites. Secondly, we tested whether this presynaptogenic effect of FGF22 was dependent on axonal translated proteins. For that, we cultured dissociated hippocampal neurons in microfluidic devices capable of physically and fluidically isolating axons. We then stimulated axons, under localized protein synthesis inhibition, with FGF22. Our results clearly show an abrogation of FGF22-induced presynaptic assembly when protein synthesis inhibitors are added to the medium, proving that FGF22 depends on translation of axonal mRNAs to exert its function. We present the first evidence that, not only axonal translation has a role in presynaptic formation in a mammalian system, but also that presynaptic organizing molecules action might rely on newly and locally synthesized proteins. Further studies will allow us to understand how FGF22 acts, revealing the intracellular events (signaling pathways, induction and regulation of local protein synthesis and mRNAs involved) that lead to the appropriate formation of presynaptic terminals.

Os neurónios são células altamente complexas e polarizadas com uma incrível rede de prolongamentos funcionalmente activos que se estendem do corpo celular. A comunicação entre neurónios ocorre numa estrutura especializada, a sinapse, normalmente distante do centro trófico do neurónio, o corpo celular. Durante vários anos, assumiu-se que as proteínas eram sintetizadas no corpo celular e enviadas para locais específicos nas dendrites e axónios, através do transporte mediado pelos microtúbulos. Contudo, novas evidências têm desafiado este modelo ao demonstrarem a ocorrência de tradução local de mRNAs, selectivamente localizados nas neurites. No passado, poucos estudos se têm focado na síntese proteica em axónios, e consequentemente, a sua relevância funcional não é clara. Actualmente, a tradução axonal parece ser essencial para vários eventos do desenvolvimento do sistema nervoso, como condução axonal, formação sináptica, plasticidade sináptica, regeneração axonal e sinalização retrógrada. Contudo, os mecanismos envolvidos estão longe de ser descortinados. O presente trabalho tem como objectivo investigar o papel da tradução axonal na pré-sinaptogénese, o mecanismo pelo qual se forma um terminal pré-sináptico. Durante a diferenciação pré-sináptica, estruturas móveis contendo material pré-sináptico como vesículas sinápticas, proteínas vesiculares e de fusão, maquinaria de reciclagem de vesículas e componentes da zona activa, acumulam-se em locais pré-definidos ao longo do eixo axonal. Para além disso, a formação de sinapses maduras também requer um correcto alinhamento entre os terminais pré- e pós-sinápticos, crescimento présináptico e remodelação do citosqueleto. Ultimamente, vários estudos têm salientado aacção de moléculas organizadoras do terminal pré-sináptico, como SynCAMs, FGF22, neuroliguinas, WNTs e trombospondinas. Neste trabalho, focámo-nos na diferenciação pré-sináptica induzida por FGF22, uma molécula solúvel secretada pelo terminal pós-sináptico alvo cuja acção indutora da agregação das vesículas sinápticas foi demonstrada recentemente em sinapses do sistema nervoso central. Este trabalho compreende duas partes distintas. Em primeiro lugar, estimulámos culturas primárias de neurónios de hipocampo de embrião de rato com FGF22 e avaliámos a agregação da sinapsina, observando-se um aumento no número e tamanho dos locais pré-sinápticos. Em segundo lugar, procurámos testar se este efeito presinaptogénico do FGF22 está dependente de proteínas traduzidas localmente. Para tal, plaqueámos neurónios de hipocampo em câmaras microfluídicas capazes de isolar, física e fluidicamente, axónios. De seguida, estimulámos axónios com FGF22, sob inibição local de síntese proteica, ou seja, apenas a nível axonal. Os nossos resultados mostram que na presença de inibidores da síntese proteica o efeito do FGF22 na formação sináptica é abolido, provando, deste modo, que o FGF22 depende da tradução de mRNAs nos axónios para exercer a sua função. Neste trabalho apresentamos a primeira evidência de que a tradução proteica axonal está envolvida na formação pré-sináptica em neurónios do sistema nervoso central de mamíferos. Por outro lado, demonstrámos pela primeira vez que moléculas organizadoras do terminal pré-sináptico requerem novas proteínas sintetizadas localmente. Experiências futuras permitir-nos-ão compreender o modo de acção do FGF22, ajudando-nos a revelar os eventos intracelulares (vias de sinalização, indução e regulação da síntese proteica local e mRNAs envolvidos) que conduzem à formação do terminal pré-sináptico.