Validation of primary hippocampal cultures for the study of neuronal dynamics

Abstract

As culturas primárias de neurónios dissociados são uma ferramenta popular em neurobiologia. Muita da informação acerca do desenvolvimento e refinamento dos circuitos neuronais foi obtida usando culturas primárias de neurónios isoladas a partir de diferentes regiões cerebrais. Estas culturas facilitam o acesso a neurónios individuais, permitindo a aplicação de métodos bioquímicos, electrofisiológicos ou de imagiologia. O efeito de manipulações farmacológicas pode ser inferido pela quantificação de alterações fenotípicas na cultura. Prepararam-se culturas primárias de neurónios de hipocampo de rato em microplacas de 96 poços. Para a optimização das culturas diferentes condições foram testadas, entre elas o uso de diferentes meios de cultura e substratos para revestimento das placas. O meio C6-CM e revestimento de Poli-D-Lisina são as condições mais indicadas para o crescimento das culturas que podem ser usadas até aos 11DIV. O nível de morte celular e agregação de neurónios é elevado depois dos 11DIV. Uma vez que se pretende usar estas culturas como modelo celular, a preparação foi caracterizada ao longo do tempo, através do uso de diferentes técnicas. As populações celulares presentes na cultura foram discriminadas através de marcadores celulares específicos. De 1DIV a 11DIV não há alteração no número de neurónios, embora o número de astrócitos e outras células aumente de 7DIV para 11DIV. Avaliou-se também o desenvolvimento neuronal e o crescimento de neurites, tendo-se observado a polarização dos neurónios em cultura e o alongamento das neurites, tal como descrito em estudos anteriores. O tamanho das neurites por neurónio aumenta para cada um dos tempos considerados.Foram analizadas as alterações fenotípicas resultantes da estimulação de neurónios do hipocampo com NGF (nerve growth factor) ou com JNJ#X. O NGF (10ng/ml) teve um efeito protector no primeiro dia da cultura, tendo aumentado o número de neurónios. As restantes concentrações testadas (de 1 a 100 ng/ml) não alteraram significativamente o número de neurónios em cultura e o comprimento dos prolongamentos. Para concentrações entre 10-6 M e 3x10-8 M o composto JNJ#X aumentou o crescimento de neurites aos 1DIV, efeito que foi também detectado aos 4DIV para a concentração de 3x10-8 M. Na presença de concentrações mais elevadas de JNJ#X (10-5 M e 10-6 M) foi observada uma diminuição do número de neurónios em cultura após 7DIV. Para a maior concentração testada (10-5 M) o JNJ#X diminuiu o crescimento de neurites aos 7DIV, indicando que esta concentração é neurotóxica. Estes efeitos são uma indicação de que as técnicas previamente descritas são válidas na detecção de alterações fenotípicas na cultura primária. A formação e maturação de sinapses durante o desenvolvimento foram avaliadas pela observação de proteínas pré- e pós-sinápticas. Tal como em estudos anteriores, os componentes pré-sinápticos foram observados a partir dos 4DIV, enquanto que os componentes pós-sinápticos foram observados apenas a partir dos 7DIV. As sinapses excitatórias foram analisadas em maior detalhe aos 7DIV e aos 11DIV. Não se verificaram diferenças significativas no número de proteínas pré- ou pós-sinápticas nem na colocalização dos marcadores sinápticos. Foram também usadas diferentes metodologias para a quantificação de espículas dendríticas. A marcação com CM-DiI permite a visualização de protuberâncias ao longo das neurites. Marcações combinadas com CM-DiI estão no momento a ser testadas para a caracterização das mesmas. A funcionalidade da cultura primária foi também investigada. Para a análise da actividade eléctrica espontânea, foram feitos estudos de imagiologia em células individuais,recorrendo ao uso de uma sonda fluorescente sensível a Ca2+. As células foram estimuladas com glutamato e as alterações da [Ca2+]i foram usadas com o objectivo de distinguir diferentes populações celulares. No entanto, foram poucas as preparações onde se observaram alterações da [Ca2+]i resultantes da actividade eléctrica espontânea.

Dissociated primary neuronal cultures are a popular research tool in neurobiology. Much of our understanding on the development and refinement of the neural circuitry sprung from the use of primary neuronal cultures isolated from different brain regions. These cultures allow the easy access to individual neurons for the application in biochemical, electrophysiological or imaging techniques. Furthermore, the effect of pharmacological manipulations can be assessed by quantifying phenotypical changes in the culture. Primary neuronal hippocampal cultures from wild type animals were prepared and grown in 96-well microplates. For the optimization of the cultures, different conditions were tested, such as different sustaining media or substrates for well coating. The best sustaining medium is C6-CM and the best well coating is Poly-D-Lysine. In these conditions the cultures can be used until 11DIV. After 11DIV, the degree of cell death and neuronal clustering is high. In order to be used as a cellular model, the cultures were characterized over time, by using different techniques. Cell populations were discriminated with the use of cell-type specific markers. From 1 to 11DIV, the number of neurons does not change, as the number of astrocytes and other cells increases from 7DIV to 11DIV. Neuronal development and neurite outgrowth were also assessed. It was observed that neurons in culture polarize and extend their processes, as described in previous studies. Neurite length per neuron is increasing in each of the timepoints considered. Phenotypical changes in the primary cultures after stimulation with NGF (nerve growth factor) or JNJ#X were assessed. NGF (10ng/ml) seems to be neuroprotective at1DIV. Other NGF concentrations tested (from 1 to 100ng/ml) did not induce significant changes neither in the number of neurons, nor in neurite outgrowth. Doses from 10-6 M to 3x10-8 M of JNJ#X increase neurite growth at 1DIV, an effect that is also detectable after 4DIV for 3x10-8 M of JNJ#X. High doses of JNJ#X (10-5 M and 10-6 M) decrease the number of neurons in culture at 7DIV. The highest tested dose of JNJ#X (10-5 M) also decreases neurite outgrowth at 7DIV, providing an indication that such dose is neurotoxic. The described changes in neuronal population and neurite outgrowth after the stimulations provide the indication that the used techniques are effective in the detection of phenotypical changes in the primary culture. Further insight on synapse formation and maturation was assessed by evaluating the distribution of pre- and postsynaptic markers during development. As previously reported, presynaptic markers were detected after 4DIV, whereas postsynaptic markers were only observed at 7DIV. Excitatory synapses were further analyzed at 7DIV and 11DIV. There were no significant changes in the number of the markers and colocalizations in this timeframe. Different methodologies were applied for the quantification of dendritic spines. Labeling with CM-DiI allows for a clear visualization of protrusions along neurites. Combined stainings with CM-DiI for the further characterization of such protrusions are currently ongoing. The functionality of the primary culture was also assessed. For the study of spontaneous electrical activity, live-cell imaging experiments were performed, with the use of a fluorescent Ca2+-sensitive probe. Cells were stimulated with glutamate and changes in [Ca2+]i were used for the discrimination of different cell types. However, traces of spontaneous electrical activity were very rare at any of the timepoints considered.