Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/28168
Title: Embriogénese somática em solanáceas: integração de sistemas modelo alternativos baseados no tamarilho
Authors: Fernandes, Patrícia Morais 
Orientador: Canhoto, Jorge Manuel Pataca Leal
Correia, Sandra Isabel Marques
Keywords: Arabidopsis thaliana; Calo embriogénico; Calo não embriogénico; Solanum melongena; Solanum muricatum
Issue Date: 2014
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: A disponibilidade de sistemas modelo de embriogénese somática (ES) permitiu criar ferramentas vantajosas para o estudo de processos de diferenciação celular vegetal e para aumentar o nosso entendimento sobre os aspetos funcionais dos genes já implicados na ES. Vários sistemas modelo têm sido amplamente utilizados na caraterização da ES, tais como Daucus carota e Arabidopsis thaliana. No entanto, as descobertas fundamentadas nestas plantas deverão ser testadas noutros organismos ou sistemas para verificar a sua efetividade. Outras espécies têm demonstrado um papel emergente no entendimento de vários processos morfológicos induzidos in vitro, sendo a beringela (Solanum melongena L.) e o tamarilho (Cyphomandra betacea Cav. Sendt. syn. Solanum betaceum) exemplos dessa situação. São dois membros da Solanaceae, uma grande e diversa família de plantas cuja importância económica e interesse biotecnológico são bem conhecidos. A beringela apresenta uma notável resposta a várias técnicas de cultura in vitro devido ao grande potencial morfogénico, sendo particularmente vantajosa na indução de ES. A disponibilidade de vários protocolos de ES eficientes, combinados com o número crescente de loci identificados, disponíveis em bases de dados, possibilita a consideração do papel desta solanácea como modelo alternativo em estudos da morfogénese in vitro. Outra solanácea promissora é o tamarilho, uma espécie lenhosa cujo protocolo de ES já se apresenta otimizado. A grande vantagem do sistema de indução nesta espécie é a formação simultânea de tecidos embriogénicos (CE) e não embriogénicos (CNE) a partir do mesmo explante (folhas ou embriões zigóticos maturos) perante as mesmas condições de cultura. A comparação de perfis proteicos de CE e CNE permitiu a identificação de proteínas expressas diferencialmente durante a aquisição da competência embriogénica, incluindo a NEP-TC (GenBank, accession number JQ766254.1), uma proteína de 26,5 kDa consistentemente presente em CNE, sugerindo um possível papel como inibidor da indução de ES no tamarilho. Esta proteína apresenta um elevado grau de homologia com a família de proteínas SpoU metiltransferases de RNA de Arabidopsis thaliana. No presente trabalho, são analisados os sistemas de indução de ES da beringela e do tamarilho numa abordagem semelhante, de forma a avaliar o seu papel como sistemas modelo alternativos em estudos de ES. Adicionalmente foi estudada outra solanácea, a pera-melão (Solanum muricatum Ait.), que apresenta um hábito intermédio entre a beringela e o tamarilho, devido às suas características semi-arbustivas. Numa fase inicial,pretendeu-se verificar se as condições de indução de ES no tamarilho poderiam ser reproduzidas nesta espécie com potencial para ser explorada comercialmente e da qual ainda pouco se sabe, revelando-se assim interessante para o estabelecimento de novos protocolos de cultura in vitro. Neste sentido, foram efetuados ensaios de ES em todas as espécies usando explantes de tecidos foliares de vários genótipos. Foram testadas várias concentrações das auxinas 2,4-D, NAA e picloram e diferentes quantidades de sacarose, 3% e 9% (w/v) para a beringela, e 9% (w/v) para o tamarilho e a pera-melão. Os resultados demonstraram diferentes respostas, tendo os tecidos de beringela e tamarilho permitido obter calo com caraterísticas embriogénicas e não embriogénicas, ao contrário da peramelão, a partir da qual apenas foi obtido calo com características não embriogénicas. A expressão do gene NEP-TC foi analisada em todos os calos obtidos e tecidos foliares de beringela, pera-melão e tamarilho, tendo a abundância dos seus transcritos sido determinada através de RT-PCR. Os resultados obtidos indicaram que os níveis dos transcritos de NEP-TC variam em todos os tecidos das solanáceas, com elevada abundância em CNE, mas também em CE, e menor expressão em folhas não induzidas, o que está em concordância com os resultados previamente obtidos no tamarilho. Também foi avaliada a capacidade de indução de ES de linhas de Arabidopsis thaliana knockout para genes da família das SpoU metiltransferases de RNA. Plantas homozigóticas para a linha de inserção foram comparadas com plantas wild type. Juntamente foram analisados aspetos morfológicos tais como, o enraizamento e o desenvolvimento da roseta e da inflorescência. Os resultados demonstraram uma taxa de indução de ES ligeiramente mais elevada na linha knockout para o gene homólogo à NEPTC e, relativamente ao desenvolvimento foram registadas diferenças significativas relativamente ao enraizamento. A informação reunida neste trabalho permite a correlação entre sistemas de indução de ES de diferentes solanáceas, que possivelmente terão o potencial para contribuir como sistemas modelo alternativos. No entanto, deverão ser efetuados mais estudos no que diz respeito à otimização do protocolo de indução de ES da beringela e ao papel funcional da NEP-TC tanto na beringela como no tamarilho. Esta proteína estará possivelmente envolvida na indução de ES como um marcador da competência nãoembriogénica e poderá auxiliar na compreensão dos mecanismos de regulação deste processo.The availability of somatic embryogenesis (SE) model systems has created effective tools for studying cell differentiation processes in plants thus increasing our understanding about the functional aspects of genes implicated on SE. Over the years, several models such as Daucus carota and Arabidopsis thaliana have been widely used to characterize SE. However, the effectiveness of the discoveries based on such plants is often difficult to be verified in other systems. In recent years, other species have demonstrated an emerging role for the understanding of various in vitro induced morphological processes. This is the case of eggplant (Solanum melongena L.) and tamarillo (Cyphomandra betacea Cav. Sendt. syn. Solanum betaceum), two members of Solanaceae, a large and diverse plant family whose economic importance and biotechnological interest are well known. Eggplant is very responsive to numerous tissue culture techniques due to a high morphogenic potential that is particularly useful for SE induction. The availability of several efficient SE protocols, combined with an increasing number of identified loci available on databases, makes this solanaceous an alternative model to be considered for studies of in vitro morphogenesis. Another promising solanaceous is tamarillo, a tree species in which effective SE protocols have been developed. One of the main advantages of tamarillo is the simultaneous formation of embryogenic (EC) and non-embryogenic (NEC) tissues from the same explant (leaves or mature zygotic embryos) under the same culture conditions. Comparative proteomic analysis of EC and NEC allowed the identification of proteins differentially expressed during the acquisition of SE competence including NEP-TC (GenBank, accession number JQ766254.1), a 26.5 kDa protein consistently present in NEC, suggesting its putative role as an inhibitor of tamarillo’s SE induction. This protein shows a high degree of identity with the Arabidopsis thaliana RNA methyltransferase (SpoU) family protein. In the present study eggplant and tamarillo SE induction systems were analyzed in a combined approach to testify their role as alternative model systems for SE studies. Additionally another solanaceous, pepino (Solanum muricatum Ait.), with an intermediate habit between eggplant and tamarillo, due to its semi-shrub characteristics, was studied. In an initial step, it was intent to reproduce the SE induction conditions for tamarillo.
The availability of somatic embryogenesis (SE) model systems has created effective tools for studying cell differentiation processes in plants thus increasing our understanding about the functional aspects of genes implicated on SE. Over the years, several models such as Daucus carota and Arabidopsis thaliana have been widely used to characterize SE. However, the effectiveness of the discoveries based on such plants is often difficult to be verified in other systems. In recent years, other species have demonstrated an emerging role for the understanding of various in vitro induced morphological processes. This is the case of eggplant (Solanum melongena L.) and tamarillo (Cyphomandra betacea Cav. Sendt. syn. Solanum betaceum), two members of Solanaceae, a large and diverse plant family whose economic importance and biotechnological interest are well known. Eggplant is very responsive to numerous tissue culture techniques due to a high morphogenic potential that is particularly useful for SE induction. The availability of several efficient SE protocols, combined with an increasing number of identified loci available on databases, makes this solanaceous an alternative model to be considered for studies of in vitro morphogenesis. Another promising solanaceous is tamarillo, a tree species in which effective SE protocols have been developed. One of the main advantages of tamarillo is the simultaneous formation of embryogenic (EC) and non-embryogenic (NEC) tissues from the same explant (leaves or mature zygotic embryos) under the same culture conditions. Comparative proteomic analysis of EC and NEC allowed the identification of proteins differentially expressed during the acquisition of SE competence including NEP-TC (GenBank, accession number JQ766254.1), a 26.5 kDa protein consistently present in NEC, suggesting its putative role as an inhibitor of tamarillo’s SE induction. This protein shows a high degree of identity with the Arabidopsis thaliana RNA methyltransferase (SpoU) family protein. In the present study eggplant and tamarillo SE induction systems were analyzed in a combined approach to testify their role as alternative model systems for SE studies. Additionally another solanaceous, pepino (Solanum muricatum Ait.), with an intermediate habit between eggplant and tamarillo, due to its semi-shrub characteristics, was studied. In an initial step, it was intent to reproduce the SE induction conditions for tamarillo. Little is known about this Solanaceae with potential to be explored commercially, revealing itself interesting for the establishment of new protocols of in vitro culture. For this purpose SE was induced in all species using explants from leaftissues from several genotypes. The assays involved SE induction on media containing different concentrations of the auxins 2,4-D, NAA or picloram and different sucrose levels, 3% and 9% (w/v) for eggplant, and 9% (w/v) for tamarillo and pepino. The results showed distinct responses, however, in both eggplant and tamarillo, responsive and nonresponsive calli could be obtained, unlike pepino that only give rise to non-responsive tissues. All cell masses were analyzed in relation with the expression of NEP-TC. The abundance of NEP-TC transcripts in several tissues of eggplant, pepino and tamarillo was determined through RT-PCR analyses. The results showed that NEP-TC transcripts levels vary in a similar way in all the solanaceous tissues, with high abundance in NEC, but also in EC and lower expression in non-induced leaf samples, which is in accordance with previous results obtained with tamarillo. Homozygous plants of knockout lines of Arabidopsis thaliana were also evaluated for their ability to undergo SE, when compared to the wild type controls. Morphogenetic aspects, such as rooting, rosette and inflorescence development were also compared. The results showed a slightly higher rate of SE the homologous gene of NEP-TC knockout line and in terms of development significant differences were registered regarding the rooting process. The information gathered in this work, allows a correlation between the SE induction of different solanaceous species that possibly have the potential to contribute as alternative model systems. However further studies should be focused on the optimization of eggplant’s SE induction protocol and the functional role of NEP-TC on both tamarillo and eggplant. This protein is possibly involved in the induction of SE as a marker of non-embryogenic competence and could help to understand the regulatory mechanisms of this process.
Description: Dissertação de mestrado em Biotecnologia Vegetal, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
URI: http://hdl.handle.net/10316/28168
Rights: openAccess
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