Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/28068
Title: Avaliação da inibição de Metaloproteinases da Matriz como alvo terapêutico em Neoplasias Hematológicas
Authors: Pires, Ana Cláudia da Costa 
Orientador: Ribeiro, Ana Bela Sarmento
Veríssimo, Paula
Keywords: Metaloproteinases da Matriz; Batimastat; Microambiente medular; Neoplasias hematológicas
Issue Date: 2014
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: O microambiente medular sendo o principal suporte da hematopoiese normal, é a estrutura que fornece proteção às células estaminais hematopoiéticas de agressões externas, bem como indicações fisiológicas necessárias à regulação destas células. No entanto, esta estrutura também é importante na formação, sustentação e desenvolvimento de clones neoplásicos. Um dos seus componentes, as metaloproteinases da matriz (MMPs), são enzimas que são responsáveis pela degradação e modulação da matriz extracelular. Estas são enzimas altamente reguladas no organismo e a mais pequena desregulação pode originar um descontrolo dos processos celulares, promovendo a formação de neoplasias. Uma vez que as terapêuticas atuais não são eficazes em todos os doentes com neoplasias hematológicas e as recidivas são frequentes, a inibição das MMPs poderá constituir uma nova abordagem terapêutica para os doentes com estas neoplasias. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial terapêutico do Batimastat (BB- 94), um inibidor das MMPs, em modelos in vitro de neoplasias hematológicas. Para o efeito, foram utilizadas quatro linhas celulares de neoplasias hematológicas, 2 de Leucemia Promielocítica Aguda, sem e com a translocação t(15;17), as células HL-60 e NB-4, respetivamente; 1 de Mieloma Múltiplo, as células H929, e 1 de Síndrome Mielodisplásica, as células F36-P. Primeiro foi determinada a expressão basal das MMPs, por Citometria de Fluxo (CF), com recurso a anticorpos específicos marcados com sondas fluorescentes. As células foram incubadas na ausência e na presença de diferentes concentrações de BB-94, entre 0,1 e 10μM, administrado em toma única ou fraccionada. Para avaliar o efeito deste inibidor na viabilidade e na densidade celular foi usado o teste de exclusão por azul de tripano. A morte celular foi avaliada por microscopia óptica, após coloração de esfregaços usando o método de May-Grünwald-Giemsa, e por CF, através da dupla marcação com Anexina V e Iodeto de Propídeo. Foi também avaliada a activação de caspases, utilizando a sonda Apostat, bem como o ciclo celular, com recurso a Iodeto de Propídeo, ambos avaliados por CF. Para confirmar a atividade gelatinolítica das MMPs, utilizou-se também o método de zimografia em gelatina, antes e após a incubação com oinibidor. Por fim, verificou-se a influência do inibidor nas vias de sinalização celular, através da expressão das proteínas ERK 1/2 e AKT, por western blot. Os resultados mostram que o BB-94 reduz a viabilidade e a proliferação celular de uma forma dependente do tempo, da dose e das características da linha celular. O IC50 do fármaco, após 48h de exposição é, aproximadamente, 7,5 μM para a linha NB-4, 10 μM para a linha F36-P e entre 7,5 e 10 μM para as linhas celulares HL-60 e H929. Além disso, os resultados sugerem que a administração diária do fármaco é mais eficaz na redução da viabilidade e da proliferação celular quando comparado à mesma dose (total) em administração única. Por outro lado, o efeito citotóxico do BB-94 é mais acentuado na linha celular de LPA que apresenta a translocação t(15;17), e este efeito aparenta ser independente da expressão de MMPs. O BB-94 induz morte celular por apoptose com activação de caspases, de forma dependente da dose. A análise do ciclo celular confirma a atividade anti-proliferativa do fármaco, uma vez que é observado um bloqueio na fase G0/G1 nas células HL-60 e H929, na fase S nas células NB-4 e na fase G2/M nas células F36-P. A zimografia em gelatina confirma a atividade do BB-94, ao ser possível observar-se um bloqueio na atividade gelatinolítica das MMPs diretamente proporcional à dose de fármaco administrada. A análise do western blot indicam que há um aumento da expressão da ERK nas células tratadas com o BB-94, quando comparado com as células sem tratamento, nas linhas celulares HL-60 e F36-P, não se observando diferenças significativas nas linhas NB-4. Por outro lado, o BB-94 induziu um aumento na expressão de AKT nas células HL-60, enquanto nas H929 foi observada uma diminuição, em comparação com o controlo. Em conclusão, estes resultados sugerem que o BB-94 poderá constituir uma potencial e nova abordagem terapêutica no tratamento de neoplasias hematológicas, apresentando um papel importante na regulação das vias de sinalização celular que controlam papéis fundamentais tanto no crescimento e desenvolvimento celular, como no controlo da morte celular. Contudo, a eficácia terapêutica poderá depender do tipo e das características genéticas da neoplasia, bem como do esquema terapêutico utilizado.
The bone microenvironment is the main support normal hematopoiesis, is the structure that provides support, protection of hematopoietic stem cells from external aggression, and provides the details required for the physiological regulation of these cells. However, this structure also important in formation support and neoplastic clones. One of its components, matrix metalloproteinases (MMPs) are enzymes that are responsible for modulation and degradation of the extracellular matrix. These are highly regulated enzymes in the body and the smallest disruption can lead to an uncontrolled cellular processes, promoting the formation of neoplasms. Since current therapies are not effective in all patients with hematological malignancies and relapses are frequent, inhibition of MMPs may constitute a novel therapeutic approach to patients with these malignancies. The aim of this study was to evaluate the therapeutic potential of Batimastat (BB-94), a matrix metalloproteinases inhibitor, in in vitro models of hematological neoplasias. For this purpose, we used four hematological neoplasia cell lines, two Acute Promyelocytic Leukemia cell lines (NB-4 and HL-60 cells, with and without the translocation t(15;17), respectively), one Multiple Myeloma cell line (H929 cells), and one Myelodysplastic Syndrome cell line (F-36P cells). We detected the protein basal expression of MMP-2, -8 and -9, by Flow Cytometry (FC) using specific antibodies. All cell lines were cultured in absence and presence of different concentrations of BB-94 ranged from 0,1 μM to 10 μM, in a daily or single dose administration. To evaluate the effect of this inhibitor on cell viability and cell density we used the Trypan Blue Assay. Cell death was determined by optical microscopy, after staining smears using the method of May-Grünwald-Giemsa, and by FC using the Annexin V and Propidium Iodide double staining. It was also evaluated the activation of caspases, using apostat probe as well as the progression through the cell cycle, using propidium iodide, both by CF. We also used gelatin zymography to confirm the gelatinolytic activity of MMPs before and after incubation with the inhibitor. In order to understand the role of BB-94 in cell proliferation, we evaluated the ERK 1/2 and AKT expression by Western Blot. Our results showed that BB-94 reduces cell viability and proliferation in a time, dose and cell line dependent manner. We found that the half maximal inhibitory concentration(IC50) at 48 hours of exposure was, approximately, 7,5 μM for NB-4, 10 μM for F36-P, and between 7,5 and 10 μM for HL-60 and H929. Furthermore, the results suggest that the daily administration schedule is more effective in the reduction of cell viability and proliferation when compared to the same doses in single administration, when compared to the same dose (total) in a single administration. Moreover, the cytotoxic effect of BB-94 is more pronounced in cell lines that presents APL translocation t(15; 17) , and this effect seems to be independent of MMPs expression levels.. BB-94 induced cell death by apoptosis with activation of caspases, in a dosedependent manner. The antiproliferative effect is confirmed through of cell cycle analysis, which revealed an arrest in G0/G1 phase in HL-60 and H929 cells, in S phase in the NB-4 cell and G2/M phase of the F36-P cells. The gelatin zymography confirmed the activity of BB- 94, to be possible to observe a block in gelatinolytic activity of MMPs directly proportional to the dose of drug. In Western Blot analysis it was observed an increase of ERK expression in the cells treated with BB-94 when compared to the cells without treatment, in HL-60 and F36-P cell lines, while in NB-4 and H929 cell lines no significat differences were observed. On the other hand, BB-94 induced an increase in AKT expression in HL-60 cell line, while in H929 a decreased was observed, compared to control. In conclusion, our results suggest that BB-94 is a potential new targeted therapy in hematological neoplasias and also support a role for the ERK and AKT signaling pathway in BB-94-induced apoptosis. However, therapeutic efficacy may depend on the cell type and genetic characteristics of the neoplasia, as well as the therapeutic schedule used.
Description: Dissertação de mestrado em Bioquímica, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
URI: http://hdl.handle.net/10316/28068
Rights: openAccess
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