Decitabine and trichostatin A : a synergistic combination in ALL

Abstract

Investigações recentes demonstraram que a regulação epigenética da expressão génica envolve a metilação regiões CpG, assim como a desacetilação, metilação e fosforilação de histonas. Estes são mecanismos – chave para o silenciamento de genes e desempenham um papel crucial na patogenia de diversos tipos de carcinomas, nomeadamente Leucemia Linfoblástica Aguda. Com este projecto pretende-se estudar o potencial efeito terapêutico de agentes hipometilantes e inibidores das desacetilases das histonas em células de Leucemia Linfoblástica Aguda T em cultura, isoladamente ou em terapêutica combinada. Para o efeito, células de LLA-T obtidas de um doente no início da doença, as células MOLT-3, e na recaída, as células MOLT-4, foram mantidas em cultura na ausência e na presença de um fármaco hipometilante, a Decitabina e/ou um inibidor das desacetilases das histonas, a Tricostatina, em diferentes concentrações e por diferentes períodos de tempo. A densidade e viabilidade celular foram analisadas recorrendo à coloração com azul de tripano e a susceptibilidade à morte celular foi avaliada por citometria de fluxo, utilizando a dupla com AnexinaV. A eficácia dos modificadores epigenéticos foi determinada pelo perfil de metilação dos genes supressores tumorais p15, p16 e p53 por PCR específico de metilação (MS-PCR). Os resultados sugerem que, em monoterapia, a Tricostatina exerce um efeito antiproliferativo e induz apoptose de forma dependente da dose e do tempo de incubação, enquanto que a Decitabina, se mostrou menos eficaz nas condições testadas. No entanto, quando às células previamente tratadas com Tricostatina se adicionou Decitabina, observou-se potenciação do efeito citotóxico dos fármacos. Concomitantemente, foi observada uma diminuição da metilação do p15. O gene p16 demonstrou baixos níveis de metilação mesme no controlo e não sofreu modificações significativas após a exposição aos fármacos.

Este estudo sugere que a modulação epigenética pode constituir uma nova abordagem terapêutica em LLA-T. No entanto a escolha e a forma de administração combinada dos fármacos parece ser crucial para a obtenção do efeito terapêutico.

Current evidence shows that epigenetic regulation of gene expression involves methylation of CpG islands, as well as deacetylation, methylation and phosphorylation of histones. These are key mechanisms in gene silencing and have a crucial role in the pathogenesis of several types of cancer, namely Acute Lymphoblastic Leukemia. With this project, we intend to study the therapeutic potential of the hypomethylating agent, Decitabine, and the histone deacetylase inhibitor, Trichostatin A in acute lymphoblastic leukemia cell lines, both as single agents and in association. For this purpose, two T-ALL cell lines, one derived from a patient in the initial stages of disease, MOLT-3 cells, and another obtained from the same patient in relapse, MOLT-4 cells, were incubated with increasing concentrations of Decitabine and/or Trichostatin A during different periods of time. Cell density and viability were analyzed by Trypan Blue exclusion assay and Alamar Blue test. Susceptibility to cell death by apoptosis was evaluated by flow cytometry using Annexin V. The efficacy of the epigenetic modifiers was determined by the methylation profile of the p15, p16 and p53 tumor suppressor genes using methylation-specific PCR The results obtained suggest that Trichostatin A as a single agent has an antiproliferative and cytotoxic effect in a dose and time dependent manner. On the other hand, Decitabine alone has a modest effect under the tested conditions. However, when Decitabine was added to cell cultures previously incubated with Trichostatin A, a synergistic antiproliferative and pro-apoptotic effects were observed. Concomitantly, changes in the methylation pattern of p15 were shown as the result of the incubation with Decitabine and Trichostatin A. For both cell lines the maximal hypomethylating effect was obtained with the association of both molecules. p16 gene was shown to have low methylation levels even in control conditions and was not significantly modified by drugs. As single agents or in association, epigenetic modulators may provide a new and effective therapeutic approach in T-cell acute lymphoblastic leukemia. However, therapeutic success seems to be highly dependent on the agents in use, the specific cancer and, as shown in this work, on the schedule of drugs administration.