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Title: Nucleic Acid Delivery Systems: From Biophysics to Biological Activity
Authors: Cardoso, Ana Maria Sequeira 
Orientador: Jurado, Amália
Lima, Conceição Pedroso de
Keywords: Sistemas de entrega de material genético; Relações estrutura-atividade; Tensioativos gemini; Péptidos permeantes; Polímeros termossensíveis
Issue Date: 23-Dec-2014
Citation: CARDOSO, Ana Maria Sequeira - Nucleic acid delivery systems : from biophysics to biological activity. Coimbra : [s.n.], 2014. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/27012
Abstract: Um número crescente de formulações, contendo moléculas conhecidas ou sintetizadas de novo, tem vindo a ser utilizado na terapia génica. A eficiência dos sistemas não-virais na entrega de ácidos nucleicos tem mostrado elevada dependência das suas características estruturais intrínsecas, que, por sua vez, condicionam as interações que estabelecem com as membranas celulares e as alterações conformacionais que sofrem no ambiente intracelular. Essas características têm, por isso, sido modeladas empiricamente com vista a aumentar a capacidade dos vetores para protegerem os ácidos nucleicos, ultrapassarem as barreiras biológicas e garantirem a libertação das moléculas transportadas nos devidos compartimentos intracelulares (citoplasma, núcleo ou mitocôndrias). É neste contexto que se insere o presente trabalho, tendo como objetivo estabelecer critérios e diretrizes que possam contribuir para uma preparação racional de novos vetores ou reformulação dos já existentes, poupando tempo, custos e recursos humanos. Com este propósito, compostos convencionais e sintetizados de novo, pertencentes a diferentes famílias químicas (tensioativos gemini, péptidos permeantes e polímeros termossensíveis) foram testados, em combinação ou não com lípidos auxiliares, como sistemas não-virais para a entrega de ácidos nucleicos, procurando, em paralelo, identificar as características estruturais de cada formulação responsáveis pelo sucesso ou insucesso da mesma na transfeção. Pequenas variações na estrutura de tensioativos gemini, tais como um aumento do comprimento das cadeias hidrocarbonadas e do espaçador, mostraram ter impacto direto na formação de arranjos supramoleculares, per se ou após complexação com DNA, com consequente repercussão na eficiência de transfeção e na citotoxicidade dos complexos. Por outro lado, o tipo de ligação (amina, amida ou éster) estabelecido entre os grupos polares e o espaçador de tensioativos gemini derivados de serina, condicionando a sua biodegradabilidade e as suas características estruturais, com impacto na complexação e proteção do DNA, bem como na extensão da sua libertação intracelular, revelou-se determinante para a eficácia de transfeção. Interações fracas entre os complexos e a membrana celular, resultando numa expectável desestabilização tardia dos complexos, com libertação do DNA na proximidade do seu alvo intracelular, revelaram contribuir igualmente para elevados níveis de transfeção. No entanto, a eficiência da entrega de DNA na mitocôndria mostrou uma boa correlação com a capacidade dos complexos com tensioativos gemini para uma extensa interação com modelos membranares de composição semelhante à das membranas mitocondriais. Por outro lado, a interação de sistemas de entrega de material genético com membranas, levando à segregação de domínios lipídicos e à formação de fases não-lamelares em membranas modelo e celulares, mostrou ser responsável pela aptidão do péptido permeante e cariofílico S4(13)-PV para transpor a membrana celular e entregar eficientemente ácidos nucleicos à célula. Além disso, a modificação estrutural deste péptido, por adição de uma cadeia de histidinas, originou complexos com eficiente capacidade endossomolítica, melhorando a entrega de DNA plasmídico e de siRNA. Finalmente, a habilidade de co-polímeros para mediarem eficientemente o silenciamento de genes mostrou beneficiar com um ajuste das proporções relativas dos respetivos blocos termossensíveis e catiónicos, repercutindo-se no equilíbrio entre interações eletrostáticas repulsivas e interações hidrofóbicas. A ocorrência de uma transição de fase dependente da temperatura revelou-se importante para que os polímeros condensassem os ácidos nucleicos em solução à temperatura ambiente e, após contacto com as células a 37 °C, os expelissem por dissociação dos complexos. Em suma, utilizando diferentes tipos de vetores, foi possível demonstrar a relevância da sua estrutura em cada etapa do processo de transfeção, desde a complexação dos ácidos nucleicos à sua libertação intracelular, evidenciando como uma modelação minuciosa das suas características estruturais os pode tornar capazes de vencer as diversas barreiras celulares. Este trabalho presta, assim, um contributo para uma melhor compreensão dos mecanismos através dos quais a composição, as propriedades físico-químicas e a arquitetura final de uma variedade de vetores não-virais influenciam a sua eficiência de transfeção, o que representa um avanço para o desenho racional de novos sistemas de entrega de ácidos nucleicos.
Increasing efforts have been made to synthesize new molecules and to prepare new formulations with pre-existing molecules aiming at their application in gene delivery. Growing evidence shows that efficient nonviral nucleic acid delivery depends on intrinsic structural characteristics of the delivery systems, as well as on their ability to interact with cellular membranes and undergo conformational changes in the intracellular environment. These properties are interdependent and have been modulated by a “trial and error” approach towards the establishment of an optimized set of architectural characteristics that provide nanocarriers with the capacity to complex and protect nucleic acids, to overcome the biological barriers imposed to nucleic acid delivery and to ensure cargo release at or close the adequate intracellular target (cytoplasm, nucleus or mitochondria). It is in this context that the present work was developed with the ultimate goal of contributing for establishing criteria and guidelines for the preparation of new vectors or the reformulation of conventional ones, as a hypothesis driven procedure, sparing time, costs and human resources. With this purpose in mind, conventional and novel compounds from different chemical families, namely gemini surfactants, cell-penetrating peptides and thermoresponsive polymers, with or without helper lipids, were tested as nonviral nucleic acid delivery systems, in an attempt to identify the structural peculiarities of each formulation responsible for its success or failure in mediating transfection. Small variations in the structure of gemini surfactants, such as the progressive increase of tail and spacer length, showed to be able to generate different supramolecular arrangements of gemini surfactants and their complexes with DNA, thus being important for the modulation of transfection efficiency and cytotoxicity of the complexes. Furthermore, the type of linkage (amine, amide or ester) established between the headgroups and spacer of serine-derived gemini surfactants produced surfactants varying in spacer length, flexibility, and biodegradability, which showed to be implicated in the structural arrangement of their complexes with DNA, their ability to release the cargo, and their transfection efficiency. These small structural alterations modulated the strength of surfactant-DNA interactions, with impact on the extent of DNA complexation and protection, and on the intracellular release of DNA. High transfection efficiency was associated with low extent of complex-membrane interactions, which resulted in late destabilization of the complexes and DNA release near its intracellular target. However, the efficiency of gemini surfactant-based complexes to deliver DNA to mitochondria showed to be dependent on enhanced interactions with membranes of composition mimicking that of mitochondrial membranes. On the other hand, nanocarrier interaction with membranes leading to lipid domain segregation and formation of nonlamellar phases in model lipid bilayers and in cell membranes showed to be responsible for the ability of the karyophilic cellpenetrating peptide S4(13)-PV to transpose the cell membrane and efficiently deliver nucleic acids into the cell. Additionally, structural modification of this peptide by the addition of a histidine tail provided the corresponding nucleic acid complexes with effective endosomolytic ability, improving plasmid DNA and siRNA delivery. Finally, change of the relative proportions of thermoresponsive and cationic blocks constituting co-polymers, which resulted in the modification of the delicate interplay between repulsive electrostatic forces and hydrophobic interactions, guided their ability to efficiently mediate gene silencing. The occurrence of a temperaturedependent phase transition allowed for the polymers to condense the nucleic acids in solution and, upon heating, the collapse of the polymer structure expelled them from the aggregates, the complexes being thus dissociated. This work provides deep insights into the mechanisms through which the composition, the physicochemical properties, and the final architecture of a variety of nonviral delivery systems, whose structure is susceptible of systematic modulation, influence their efficiency in mediating transfection. Using different types of nucleic acid delivery systems, we were able to show the relevance of their structure to each step of transfection, from complexation of nucleic acids to their intracellular release. This work shows that the modulation of structural features of the molecules used for nucleic acid delivery allows a fine tuning of the overall ability of the vectors to overcome the barriers imposed by the cells, thus representing a step forward towards the rational design of new nucleic acid delivery systems.
Description: Tese de doutoramento em Biociências, na especialidade de Bioquímica, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/27012
Rights: openAccess
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