Meloidogyne Hispanica parasitism genes : molecular and functional characterization

Abstract

O nemátode-das-galhas-radiculares (NGR), Meloidogyne hispanica (Mhi), tem sido detetado em todos os continentes associado a uma grande diversidade de plantas hospedeiras. Os objetivos principais deste estudo foram determinar as funções de genes efetores de M. hispanica na interação entre a planta hospedeira e o nemátode e contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias de controlo. Em virtude de não existirem dados genómicos disponíveis para M. hispanica, alguns genes ortólogos foram selecionados, a partir de genes modelo do genoma de M. incognita e M. hapla, no "National Center for Biotechnology". Foram desenhados primers para as regiões conservadas dos efetores selecionados de M. incognita e M. hapla e usados para amplificar estes genes em M. hispanica. Este processo levou à amplificação dos genes efetores de M. hispanica: anexina-2 (nex-2); β-1,4- endoglucanase-1 e 2 (eng-1 e eng-2); cisteína protease L-catepsina (cpl-1); calreticulina (crt-1); proteína de ligação de ácidos gordos e retinol (far-1); transferase glutationa-S (gsts-1); dismutase superóxido de manganésio (mnsod); liase pectase 3 (pel-3); poligalacturonase (gp-1); proteína semelhante à alérgica do veneno 1 e 2 (vap-1 e vap-2) e 14-3-3a (14-3-3a). Os genes Mhi-cpl-1, Mhi-crt-1, Mhieng- 1, Mhi-far-1, Mhi-mnsod e Mhi-vap-1 foram diferencialmente expressos durante o desenvolvimento de M. hispanica. O cDNA foi amplificado a partir do mRNA de ovos, jovens do segundo estádio (J2) e fêmeas. Os genes Mhi-cpl-1, Mhi-crt-1, Mhi-far- 1 e Mhi-vap-1 foram detetados em todas as fases do desenvolvimento, sugerindo terem um papel em vários aspectos do ciclo de vida. No entanto, o nível de expressão mais elevado de Mhi-vap-1 foi nos J2. O gene Mhi-eng-1 foi expresso nos ovos e J2 e pode ter uma função nas primeiras fases da infecção. A expressão de Mhi-mnsod nos ovos indica que este gene poderá ter uma função na embriogénese e eclosão dos J2. Os genes cpl-1, crt-1, far-1, eng-1, mnsod e vap-1 foram sequenciados em M. arenaria, M. hapla, M. hispanica, M. incognita e M. javanica e os resultados da análise filogenética mostraram que M. hapla é a espécie mais divergente. A análise filogenética das sequências previstas para as proteínas FAR-1 e VAP-1 entre M. hispanica, outras espécies de NGR e outros nemátodes fitoparasitas revelou existir um elevado grau de conservação entre M. hispanica e as outras espécies. Os padrões de expressão temporal e espacial dos genes efetores Mhi-vap-1 e Mhi-far-1 foram analisados nos J2 através de hibridização in situ. Estes xviii transcritos foram localizados nas glândulas esofágicas subventrais, o que sugere que estas proteínas são produzidas pelos J2 e que poderão ter um papel importante nas primeiras fases do processo de infeção. Para avaliar a função do gene Mhi-vap-1 no parasitismo, foi utilizada a metodologia associada ao RNA de interferência (RNAi). O nível dos transcritos do gene vap-1 diminuiu às 48 h, indicando ser um gene susceptível ao RNAi. Na atração e penetração de J2 nas raízes de tomateiro, após tratamento com dsRNA para o silenciamento do gene Mhi-vap-1, foi possível observar, pela primeira vez, uma redução significativa do número de J2, confirmando a função deste gene no processo de infeção. Também foi detetado, pela primeira vez, que os exsudatos de raízes de tomateiro induzem alterações na expressão de alguns genes. A expressão dos genes Mhi-cpl-1, Mhi-crt-1, Mhi-far-1 e Mhi-vap-1 aumentou nos J2 após a exposição aos exsudatos de tomateiro. Estes genes, provavelmente, têm uma função estratégica nas fases iniciais do processo de infeção e sua sobreexpressão antes da infecção poderá contribuir para o sucesso do seu parasitismo. A infeção altera diferencialmente a expressão génica de numerosos genes de plantas e este estudo mostrou a expressão diferencial de PR-1 e WRKY1 no tomateiro suscetível cv. Easypeel e no pimentão resistente cv.Solero após inoculação de J2 de M. hispanica. O gene PR-1 no tomateiro pode também contribuir para o processo de regulação das primeiras vias metabólicas de defesa da planta hospedeira e nos primeiros eventos da interação nemátode-planta. A sua expressão diferencial durante o parasitismo pode estar correlacionada com os diferentes estágios de desenvolvimento dos nemátodes. Para além da identificação de vários genes efetores em M. hispanica, procedeu-se à sua caracterização molecular durante o processo de infeção e possível função durante o parasitismo. Este estudo também analisou o efeito da infeção por nemátodes em dois genes importantes de defesa das plantas e as vias de sinalização que ocorrem na rizosfera antes da penetração do nemátode. Os resultados contribuem para o conhecimento e compreensão da interação nemátode-planta e indicam algumas perspetivas para o desenvolvimento de estratégias para o controlo de M. hispanica.

of the M. hispanica effectors genes: annexin-2 (nex-2); β-1,4-endoglucanase-1 and 2 (eng-1 and eng-2); cathepsin L cysteine protease (cpl-1); calreticulin (crt-1); fatty acid and retinol binding protein (far-1); glutathione-S-transferase (gsts-1); manganese superoxide dismutase (mnsod); pectase lyase 3 (pel-3); polygalacturonase (gp-1); venom allergen-like protein 1 and 2 (vap-1 and vap-2) and 14-3-3a (14-3-3a). The Mhi-cpl-1, Mhi-crt-1, Mhi-eng-1, Mhi-far-1, Mhi-mnsod and Mhi-vap-1 genes were shown to be differentially expressed during M. hispanica development. The cDNA was amplified from mRNA from eggs, second-stage juveniles (J2) and females. The Mhi-cpl-1, Mhi-crt-1, Mhi-far-1 and Mhi-vap-1 genes were present in all developmental stages, suggesting having a role in various aspects of the life cycle. However, Mhi-vap-1 showed the highest level of expression in J2. The Mhi-eng-1 gene was expressed in eggs and J2 and may have a function in the early events of infection. The expression in eggs of Mhi-mnsod indicates that this gene could have a role in the embryogenesis and hatching of J2. Meloidogyne arenaria, M. hapla, M. hispanica, M. incognita and M. javanica cpl-1, crt-1, far-1, eng-1, mnsod and vap-1 genes were sequenced and phylogenetic studies revealed that M. hapla is the most divergent species. Phylogenetic analysis of the FAR-1 and VAP-1 predicted protein sequences between M. hispanica, other RKN species and other plant-parasitic nematodes indicated towards a high degree of conservation between M. hispanica and the other species. The temporal and spatial expression patterns of far-1 and vap-1 effector genes were analyzed in J2 by in situ hybridization. These transcripts were localized within the subventral oesophageal glands which suggest that these proteins are secreted by J2 and could play a crucial role in the early stages xvi of the infection process. RNA interference (RNAi) was used to evaluate the putative role of the Mhi-vap-1 gene in the parasitism, the transcript level of vap-1 gene in J2 decreased after incubation with dsRNA for 48 h, indicating the susceptibility of this gene to RNAi. It was showed for the first time that a significant reduction in nematode attraction and penetration of tomato roots was observed when M. hispanica J2 were treated with dsRNA to silence the Mhi-vap-1 gene. Therefore, the nematode effector Mhi-vap-1 gene seems to play an important role in the infection process. It was also reported for the first time that tomato root exudates induce changes in the gene expression of some nematode candidate parasitism genes. Gene expression of Mhi-cpl-1, Mhi-crt-1, Mhi-far-1 and Mhi-vap-1 genes were up-regulated in the pre-parasitic J2 after exposure to tomato root exudates. Possibly, these candidate parasitism genes have a strategic function during the early events of infection and their up-regulation prior to root infection may contribute to their successful parasitism. Nematode infection differentially changes the gene expression of numerous plant genes and this study showed differential expression of PR-1 and WRKY1 upon nematode infection in the susceptible tomato cv. Easypeel and in the resistant pepper cv. Solero. The PR-1 gene in tomato may also contribute to the process of regulation of primary host plant defence pathways and in the early events of the compatible plant-nematode interaction. Its differential expression during parasitism might be co-related with the presence of different nematode development stages. Several M. hispanica effector genes were identified and a detailed insight of their molecular characterisation, during the infection process and function during parasitism, was provided. This study also analysed the effect of nematode infection on two important plant defence genes and the signalling occurring in the rhizosphere before nematode penetration. The results contribute to further understanding the plant-nematode interaction and offer some possible avenues for the development of novels strategies for the management of M. hispanica.