Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/26193
Title: Influência do stresse oxidativo na morte de células de Leucemia Aguda em cultura : relação com os níveis de 5-hidroximetilcitosina
Authors: Leite, Joana Filipa da Silva 
Orientador: Ribeiro, Ana Bela Sarmento
Marques, Maria Paula
Keywords: Leucemia; Stresse Oxidativo5-hidroximetilcitosina; Espécies Reactivas; 5-hidroximetilcitosina
Issue Date: 2012
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é uma neoplasia do sistema hematopoiético que resulta da transformação maligna das células progenitoras linfoides, B ou T, com consequente desregulação da proliferação e/ou bloqueio da diferenciação destas células, conduzindo à acumulação de células imaturas (linfoblastos). No entanto, a maioria das alterações genéticas que ocorrem na LLA não são suficientes para induzir a progressão da doença, o que sugere que existem outros factores genéticos e epigenéticos que contribuem para a transformação leucémica. Um dos mecanismos envolvidos na morte celular por apoptose e/ou proliferação anómala da célula tumoral pode estar relacionado com a produção de radicais livres de oxigénio. Estas espécies reactivas de oxigénio (ROS) são poderosos agentes indutores de lesões do ADN, podendo contribuir para a inactivação de genes supressores tumorais ou para a activação de proto-oncogenes. Contudo, a célula possui um conjunto de defesas antioxidantes, enzimáticas e não enzimáticas, responsáveis pela prevenção das lesões oxidativas. Outro mecanismo implicado no desenvolvimento e progressão do cancro, especialmente no sistema hematopoiético, é a modulação epigenética. Sabe-se que diversos genes supressores tumorais são inactivados devido à hipermetilação das regiões promotoras. Diversos estudos sugerem que as lesões oxidativas do ADN podem afectar os padrões de metilação, levando à expressão génica anómala o que pode contribuir para o desenvolvimento do cancro. Neste sentido, os principais objectivos deste trabalho foram avaliar o papel das espécies reactivas de oxigénio, em particular do peróxido de hidrogénio e do anião superóxido, nos mecanismos de morte celular de células de leucemia linfoblástica aguda em cultura, e a sua relação com o estado de metilação em particular com os níveis de 5-hidroximetilcitosina, de forma a perceber a importância destas alterações e suas repercussões no tratamento da doença. Para atingir estes objectivos foi utilizada uma linha celular de leucemia linfoblástica aguda T, as células CEM. Para avaliar o efeito do stresse oxidativo na proliferação/densidade e viabilidade, das células CEM recorreu-se ao teste de exclusão com azul tripano, após incubação das mesmas na ausência e na presença de diferentes concentrações de peróxido de hidrogénio e menadiona (dador do anião superóxido) IV durante 24 a 72h. Os níveis intracelulares do H2O2, do O2 - e da defesa antioxidante não enzimática GSH, foram determinados por citometria de fluxo através das sondas fluorescentes DCFH-DA, DHE e Alaranjado de Mercúrio, respectivamente. O potencial de membrana mitocondrial foi analisado por citometria de fluxo através da sonda JC-1. A morte celular foi avaliada por microscopia óptica (coloração de May-Grünwald- Giemsa), por citometria de fluxo com a dupla marcação anexina V e iodeto de propídeo e pela avaliação dos níveis de expressão de proteínas envolvidas nos processos de morte celular, como as proteínas BAX, BCL-2, FAS, FAS ligando e caspases. O ciclo celular também foi avaliado por citometria de fluxo através da marcação com Iodeto de Propídeo/RNase. A hidroximetilação global do ADN (níveis de 5-hidroximetilcitosina,5-hmC) das células tratadas com diferentes concentrações de indutores do stresse oxidativo foi analisada através de um kit comercial baseado num teste imuno-enzimático. Os resultados obtidos mostram que o peróxido de hidrogénio e a menadiona induzem diminuição da viabilidade celular de uma forma dependente da concentração. A avaliação da morte celular por microscopia óptica e citometria de fluxo mostram que estes compostos induzem morte celular principalmente por apoptose, o que está de acordo com o aumento das caspases activadas, da proteína pró-apoptótica BAX e do receptor FAS. A diminuição do potencial mitocondrial e o aumento do pico pré-G0/G1 visualizado na análise do ciclo celular suportam os resultados anteriores. Estes compostos também induzem bloqueio do ciclo celular em fase S, o que poderá estar relacionado com lesão oxidativa do ADN. Além disso, as células submetidas aos indutores de stresse oxidativo mostram níveis de expressão de H2O2, de O2 - e de GSH aumentados. Finalmente, também se observou diminuição da quantidade de 5- hidroximetilcitosina, o que pode resultar num ou de um estado de hipometilação generalizado. Em conclusão, este estudo sugere que, apesar da presença de baixas concentrações de H2O2 e de O2 - induzirem proliferação celular, níveis mais elevados destas espécies reactivas podem levar à morte celular por apoptose. A persistência do stresse oxidativo pode também causar alterações no estado de metilação do ADN, e consequentemente nos níveis de 5-hidroximetilcitosina. Desta forma, torna-seevidente que os indutores do stresse oxidativo além de poderem constituir uma nova abordagem terapêutica em neoplasias hematológicas, poderão interfererir nos mecanismos de regulação epigenética.
Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is an hematological neoplasia characterized by the malignant transformation of lymphocyte progenitor cells of the B- or T-cell lineages, leading to a block of differentiation of these cells and therefore to an accumulation of immature cells (lymphoblasts). However, most of the genetic alterations that occur in the ALL are not sufficient to induce disease progression, suggesting that other genetic and epigenetic alterations that can contribute to leukemic transformation. One of the mechanisms involved in apoptotic cell death and/or abnormal proliferation of tumor cells may be related to the production of oxygen free radicals. These reactive oxygen species (ROS) are powerful agents that induce DNA damage and may contribute to the inactivation of tumor suppressor genes or for the activation of proto-oncogenes. Nevertheless, the cell has a set of antioxidant defenses, enzymatic and non-enzymatic, responsible for the prevention of oxidative damage. Another mechanism involved in the development and progression of cancer, especially in the hematopoietic system, is the epigenetic modulation. Many well established tumor suppressor genes have been shown to be inactivated predominantly by promoter hypermethylation. Several studies have suggested that the oxidative DNA damage may affect methylation patterns, leading to abnormal gene expression and possibly contributing to the development of malignancy. The main objectives of this study was to evaluate the role of reactive oxygen species, in particular hydrogen peroxide and the superoxide anion, in the mechanisms of cell death in ALL cell culture and the relationship with methylation status, namely with 5- hydroxymethylcytosine (5-hmC) levels, in order to realize the importance of such changes and the implications in disease treatment. For this purpose, we used a well established ALL T cell line, the CEM cells. To evaluate the effect of oxidative stress on cell viability and growth, CEM cells were treated in the absence and presence of different concentrations of hydrogen peroxide and menadione (O2 - donor) and were analyzed by the trypan blue assay, during 72h. The intracellular levels of H2O2, O2 - and the non-enzimatic antioxidant defense, GSH, were determined by flow cytometry (FC), using the probes DCFH-DA, DHE and OrangeMercury, respectively. Mitochondrial potential was also analyzed by FC using the JC-1 probe. Cell death was determined by optical microscopy (May-Grünwald-Giemsa staining), by FC using the annexin V and propidium Iodide double staining and by the expression levels of molecules involved in cell death, like BAX, BCL-2, FAS, FAS ligand and caspases. The cell cycle of leukemic cells was also evaluated by FC by staining with propidium iodide/RNase. The overall DNA hydroxymethylation (5-hmC levels) from cells treated with different concentrations of inductors of oxidative stress were examined using a commercial kit based on a immuno-enzymatic assay. Our results show that hydrogen peroxide and menadione induce a decrease in cell viability in a dose and time dependent manner. Evaluation of cell death by optical microscopy and FC showed that these compounds induce cell death mainly by apoptosis, which is in agreement with the increase of activated caspases, the proapoptotic protein BAX and FAS receptor. The decrease in mitochondrial potential and an increase in peak pré-G0/G1 visualized in cell cycle analysis support these findings. These compounds also induce S phase arrest, suggesting DNA damage. Additionally, cells treated with inductors of OS show an increase in the expression levels of H2O2, O2 - and GSH. Finally, we also observed a decrease in amount of 5- hydroxymethylcytosine, which can result in or of a state of generalized hypomethylation. In conclusion, this study suggests that despite the presence of low concentrations of H2O2 e de O2 - induce cell proliferation, higher levels of these reactive species can lead to cell death by apoptosis. The persistence of oxidative stress can also cause changes in DNA methylation state, consequently in levels of 5-hydroxymethylcytosine. suggesting that the reactive oxygen species may play a role in the mechanisms of epigenetic regulation and influence the response to therapy. Thus, it is clear that inductors of oxidative stress could constitute a new therapeutic approach in haematological malignancies, and may also interfere with epigenetic regulation mechanisms.
Description: Dissertação de mestrado em Bioquímica apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/26193
Rights: openAccess
Appears in Collections:FCTUC Ciências da Vida - Teses de Mestrado

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