Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/26081
Title: Biosynthesis of rare methylglucose lipopolysaccharides in rapidly-growing mycobacteria : characterization of a key hydrolase
Authors: Costa, Maria Mafalda Santos 
Orientador: Empadinhas, Nuno
Alarico, Susana
Keywords: Mycobacterium hassiacum; Glucosilglicerato; Hidrolase; Lipopolissacárido de metilglucose (MGLP)
Issue Date: 2013
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: Mycobacterium tuberculosis is the most infamous member among mycobacteria, although this genus already contains over 160 species, many of which opportunistic pathogens. These nontuberculous mycobacteria (NTM) are ubiquitous inhabitants of soils and waters and the cause of atypical infections frequently acquired in natural and man-made environments namely water distribution systems and hospitals. The emergence of drug- and disinfectant-resistant strains claims for urgent measures to fight these pathogens. The adaptive success and resilience of mycobacteria is intimately associated to a lipid-rich cell wall that includes a thick layer of mycolic acids, which is impermeable to many antimicrobial agents and an effective barrier to host defenses. Mycobacteria produce unique polymers namely the intracellular polysaccharides of methylglucose (MGLP) or methylmannose (MMP), which have indirect but crucial involvement in cell wall biogenesis as they modulate the synthesis of fatty-acids, the precursors of mycolic acids. Although MGLPs and MMPs have been discovered decades ago, only recently have their biosynthetic pathways been investigated at the genetic detail. The primer for MGLP synthesis is glucosylglycerate (GG), which was shown to accumulate during growth in nitrogen-starved M. smegmatis but not in nitrogen-rich medium. The addition of a nitrogen source to nitrogen-restricted cultures led to depletion of GG, implying the existence of an enzyme for its hydrolysis. We selected M. hassiacum to investigate the fate of GG during growth in nitrogen-depleted versus nitrogen-rich media. Since a hydrolase with GG-hydrolytic activity had recently been described in thermophilic bacteria, we probed this organism’s genome and cloned the homologous gene. The purified recombinant GG hydrolase (GgH) specifically hydrolysed GG to glucose and glycerate at 42ºC and pH 5.7 (optimal conditions), with Mg2+ and KCl significantly enhancing activity and GgH stability. The enzyme exhibited Michaelis-Menten kinetics at 37, 42 and 50ºC with comparable catalytic efficiencies. The purified GgH showed a single 51.2 kDa band on denaturing electrophoresis, but behaved as a dimeric protein in solution with a molecular mass of about 108.9 ± 2.6 kDa in size-exclusion chromatography. Since GgH activity likely depletes cellular GG and may represent a regulatory node in MGLP biosynthesis, the understanding of the regulation of its expression by nitrogen fluctuations is crucial. The unique biochemical features of a novel enzymatic function reported here, furthers our knowledge of mycobacterial metabolism, physiology and lifestyle, and may lead to new strategies to fight infections caused by these ominous bacteria.
Mycobacterium tuberculosis é a espécie mais ameaçadora do género Mycobacterium, que à data inclui mais de 160 espécies, na sua maioria espécies ambientais designadas não-tuberculosas (MNT), que podem ser patogénios oportunistas. As MNT são habitantes ubíquos de solos e águas de ambientes naturais ou artificiais, incluindo sistemas de distribuição de águas e hospitais. O surgimento de estirpes resistentes a antibióticos e desinfectantes reforça a necessidade urgente de medidas para combater infecções provocadas por estes patógenios. O sucesso adaptativo e resiliência das micobactérias está intimamente associado à sua parede celular rica em lípidos, que inclui uma espessa camada de ácidos micólicos, o que a torna uma estrutura impermeável a agentes antimicrobianos e uma importante barreira contra defesas dos hospedeiros. As micobactérias sintetizam polímeros únicos, incluindo os polissacáridos intracelulares de metilglucose (MGLP) e de metilmanose (MMP), que têm um papel crucial na biogénese da parede, uma vez que modulam a síntese de ácidos gordos, os precursores dos ácidos micólicos. Embora o MGLP e o MMP tenham sido descobertos há décadas, só recentemente as suas vias de biossíntese foram investigadas ao nível genético. O precursor da síntese do MGLP é glucosilglicerato (GG), um metabolito acumulado por M. smegmatis em condições limitantes de azoto. A adição de uma fonte de azoto levou à diminuição dos níveis de GG, implicando a existência de uma enzima dedicada à hidrólise deste composto. Seleccionámos M. hassiacum para investigar a dinâmica de acumulação de GG durante o crescimento em meio com limitação de azoto versus meio rico em azoto. Uma vez que foi recentemente identificada uma enzima capaz de hidrolisar GG, o gene homólogo de M. hassiacum foi detectado no genoma e clonado. A GG hidrolase (GgH) recombinante hidrolisa GG em glucose e glicerato a 42ºC e pH 5.7 (condições óptimas). Os iões Mg2+ e KCl potenciam a actividade e a estabilidade da GgH. A enzima exibe cinética Michaelis-Menten a 37, 42 e 50ºC com eficiência catalítica comparável. A GgH apresenta-se com 51.2 kDa em gel desnaturante, mas comporta-se como um dímero de massa 108.9 ± 2.6 kDa em solução. Sendo a GgH a possível responsável pelo consumo do GG intracelular e pela regulação da biossíntese do MGLP, estudos futuros para melhor compreender a regulação da expressão deste gene durante flutuações de azoto são essenciais. As características bioquímicas desta enzima descritas neste trabalho, contribuem para o conhecimento do metabolismo, da fisiologia e do modo de vida micobacteriano, podendo levar ao desenvolvimento de estratégias para combater as infecções provocadas por micobactérias.
Description: Dissertação de mestrado em Bioquímica, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
URI: http://hdl.handle.net/10316/26081
Rights: openAccess
Appears in Collections:FCTUC Ciências da Vida - Teses de Mestrado

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