Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/26044
Title: Avaliação de alterações genéticas e epigenéticas envolvidas na susceptibilidade a cancro na síndrome de Down
Authors: Guarino, Patrícia Isabel Silva 
Orientador: Ribeiro, Ana Bela Sarmento
Marques, Maria Paula
Carreira, Isabel Marques
Keywords: Síndrome de Down; Metabolismo do folato; Variabilidade genética; Epigenética
Issue Date: 2012
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: A Síndrome de Down (SD) é a forma mais comum de aneuploidia constitucional, afectando cerca de 1 em cada 700 nascimentos. As crianças com SD apresentam um risco aumentado de desenvolver cancro 10 a 20 vezes, relativamente a crianças sem SD, em particular leucemias agudas, nomeadamente Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) e Leucemia Mieloblástica Aguda (LMA), mais especificamente o subtipo Leucemia Aguda Megacarioblástica (LAMeg). Pelo contrário, verifica-se baixa incidência de tumores sólidos nas crianças com SD (Rabin and Whitlock, 2009). Alguns genes localizados na banda 21q22 estão associados ao aumento da incidência de leucemia na SD, nomeadamente os genes ERG, ETS2 e RUNX1. Estes genes codificam factores de transcrição que estão envolvidos quer na hematopoiese, quer na megacariopoiese (Fonatsch, 2010; Stankiewicz et al., 2009). Por outro lado, o folato desempenha um papel chave na manutenção da estabilidade genómica, na metilação do ADN de diversos genes, em particular genes envolvidos na regulação do ciclo celular e genes que codificam enzimas reparadoras do ADN (p16, p15, DAPK e MGMT, respectivamente). O metabolismo do folato pode ser influenciado pelos hábitos alimentares e por polimorfismos no transportador de folato reduzido (RFC), e nas enzimas metiltetrahidrofolato redutase (MTHFR) e cistationina beta-sintetase (CBS), desempenhando um papel importante na susceptibilidade a aneuploidias e no desenvolvimento de eventos iniciais na carcinogénese. Este estudo teve como objectivos o estudo dos níveis de expressão dos genes ETS2, CBS, SOD1 e RUNX1 do cromossoma 21, assim como a análise da prevalência de variantes polimórficas em genes envolvidos no metabolismo do folato, da enzima antioxidante Cu/Zn SOD1 e o padrão de metilação dos genes p15, p16 DAPK e MGMT de forma a identificar o seu papel na ocorrência de aneuploidias, nomeadamente em doentes com SD. Para tal, nós analisámos as variantes polimórficas 844ins68 e T833C (cosegregadas em cis) do gene CBS, A251G do gene SOD1, A80G do gene RFC1 e A1298C do gene MTHFR por técnicas de PCR-RFLP em 31 amostras de fibroblastos de fetos com SD e em 30 amostras de sangue periférico de controlos saudáveis. O perfil de metilação dos genes p15, p16, DAPK e MGMT foram analisados a partir do ADN convertido com bissulfito através da técnica de MSP. Por outro lado, os níveis de expressão dos genes ETS2, CBS, SOD1 e RUNX1 foram analisados por RT-PCR em tempo real. Os nossos resultados mostram que o alelo 844ins68 wild type apresenta uma frequência alélica na SD e nos controlos de 90%. Nos controlos, foram observados cerca de 3% de homozigóticos para 844ins68 do gene CBS, 13% de heterozigóticos e 84% sem inserção, enquanto na SD observou-se uma frequência de 0%, 19% e 81%, respectivamente. Para além disto, observámos que as frequências alélicas da forma wild type dos polimorfismos de SOD1, RFC1 e MTHFR (alelo A) são semelhantes nos controlos e na SD (SOD1: 92% e 90%; RFC1: 52% e 50%; MTHFR: 70% e 69%, respectivamente para os controlos e para a SD). Resultados semelhantes foram observados nos genótipos de SOD1 e MTHFR analisados (SOD1: 83% e 80% AA, 17% e 20% AG, e 0% GG; MTHFR: 13% e 10% AA, 33% e 42% AC, e 53% e 48% CC, respectivamente para os controlos e para a SD). Por outro lado, o genótipo AA do RFC1 apareceu com menor frequência na SD (19%) comparado com os controlos (27%). As frequências genótipicas observadas não apresentam um desvio ao Equilíbrio de Hardy-Weinberg, excepto no caso dos controlos no gene CBS. A força de associação entre os polimorfismos e o risco para a SD foi medida através da avaliação do risco associado (Odd’s ratio) com um intervalo de confiança de 95% (IC95%), não tendo sido observada relação significativa entre estes polimorfismos e a SD. Contudo, a forma wild type para 844ins68 do gene CBS (OR=0.833; CI95% 0.2248-3.089), o genótipo AA de SOD1 (OR=0,8333; CI95% 0.2248- 3.089) e o genótipo AA de RFC1 (OR=0,6600; CI95% 0.1980-2.200) podem ter um efeito protector. Por outro lado, a variante 844ins68 do gene CBS (OR=1.560; CI95% 0.3927-6.198), o genótipo AG de SOD1 (OR=1.20; CI95% 0.3237-4.448) e genótipo AC de MTHFR (OR=1.444; CI95% 0.5095-4.095) podem ser factores de risco para esta patologia. Além disso, a metilação do ADN mostra que os genes p15, p16, DAPK e MGMT estão todos desmetilado nos fetos com SD. Finalmente, o estudo da expressão génica de genes localizados no cromossoma 21 não revelou diferenças significativas na variação dos níveis de expressão dos genes, apesar da existência de três cópias dos genes estudados. Este facto pode dever-se a mecanismos reguladores dos genes durante o desenvolvimento embrionário. Além disso, não foram encontradas associações estatisticamente significativas entre os polimorfismos ou o perfil de metilação e os fetos com SD. O aumento do número de amostras de doentes e de controlos poderá contribuir para uma melhor análise do risco destes polimorfismos no desenvolvimento de SD.
Down Syndrome (DS) is the most common constitutional aneuploidy with on incidence of 1 in 700 births. Children with DS have a 10- to 20-fold higher relative risk for leukemia than children without DS, in particular acute leukemia, including acute lymphoblastic leukemia (ALL) and acute myeloid leukemia (AML), more specifically the subtype acute megakaryoblastic leukemia (AMKL). In contrast, the risk of developing solid tumors is lower in children with DS (Rabin and Whitlock, 2009). Some genes located on region 21q22 are associated with increased risk of incidence of leukemia in children with DS, including genes ERG, EST2 and RUNX1. These genes encode transcription factors that are involved in hematopoiesis and megakaryopoiesis (Fonatsch, 2010; Stankiewicz et al., 2009). On the other hand, folic acid plays a key role in the maintenance of genomic stability, DNA methylation of several genes, particularly those involved in cell cycle regulation and DNA repair enzymes (p15, p16, DAPK and MGMT, respectively). Folic acid metabolism may be influenced by dietary habits and genetic polymorphism of Folate Carrier Transporter (RFC), Methyl Tetrahydrofolate Reductase (MTHFR) and cystathionine beta-synthase (CBS) enzymes, playing an important role in susceptibility to aneuploidy and to the development of early events in carcinogenesis. The aims of this study are to analyze expression levels at gene localized in chromosome 21, namely ETS2, CBS, SOD1 e RUNX1, as well as to analyse the prevalence of polymorphic of genes involved in folate metabolism, in Cu/ZnSOD antioxidant enzime and the methylation pattern of p15, p16, DAPK and MGMT genes, in order to identify its role in the occurrence of aneuploidies such Down Syndrome and its association with neoplasias development. For this purpose, we analyzed polymorphic variants CBS 844ins68 and T833C (co-segregate in cis), SOD1 A251G, RFC1 A80G and MTHFR A1298C by PCRRFLP assay in 31 fibroblasts samples of children with DS and in 30 perypheral blood samples of healthy controls. Methylation pattern of p15, p16, DAPK and MGMT genes were analyzed in bisulfite converted DNA by MSP assay. On the other hand, levels expression of ETS2, CBS, SOD1 and RUNX1 genes expression levels were analysed by real time PCR. Our results show that wt 844ins68 CBS allelic frequency in DS and in controls was 90%. In controls, about 3% of 844ins68 homozygous, 13% of 844ins68 heterozygous and 84% without this insertion were observed for CBS gene, while in DS it was 0%, 19% and 81% respectively. Moreover, we observed that wild type allelic frequency of SOD1, RFC1 and MTHFR polymorphisms (A allele) were similar in controls and DS (SOD1: 92% and 90%; RFC1: 52% and 50%; MTHFR: 70% and 69%, respectively for controls and DS). Similar results were observed in SOD1 and MTHFR genotype analysis (SOD1: 83% and 80% AA, 17% and 20% AG and 0% GG genotypes; MTHFR: 13% and 10% AA, 33% and 42% AC and 53% and 48% CC genotypes, respectively for controls and DS). On the other hand, RFC1 AA genotype was decrease in DS (19%) compared to controls (27%). The genotypic frequencies observed did not show deviation from Hardy-Weinberg equilibrium, except in CBS gene. The strength of association between polymorphisms and DS risk was assessed by odds ratio (OR) with the corresponding 95% confidence interval (CI95%). No significant relation was observed between these polymorphisms and DS. However, CBS wild type 844ins68 (OR=0.833; CI95% 0.2248-3.089), SOD1 AA (OR=0,8333; CI95% 0.2248-3.089) and RFC1 AA genotypes (OR=0,6600; CI95% 0.1980-2.200) could have a protective effect. On the other hand, CBS variant 844ins68 (OR=1.560; CI95% 0.3927-6.198), SOD1 AG genotype (OR=1.20; CI95% 0.3237-4.448) and MTHFR AC (OR=1.444; CI95% 0.5095-4.095) genotypes might be risk factors for this pathology. Furthermore, DNA methylation analysis reveals that p15, p16, DAPK and MGMT genes were all unmethylated in fetus with DS, suggesting that these genes will not be inactivated by methylation of promoter, a mechanism often found in tumors. Finally, the study of gene expression of genes located on chromosome 21 showed no significant differences on levels of gene expression despite the existence of three copies of genes studied. This may be caused by regulatory mechanisms of genes during fetal development. Besides, no statistical association was detected between these polymorphisms or the methylation status in fetus with DS. The increase in patients and controls samples could contribute to a better risk analysis of the influence of these polymorphisms in DS development and its association with a higher incidence of cancer in these patients.
Description: Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
URI: http://hdl.handle.net/10316/26044
Rights: openAccess
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