"Optimization of protein expression and purification for the characterization of Laforin-Malin interaction"

Abstract

Glycogen is a branched and soluble polymer of glucose, present in cells functioning as energy storage. Its accumulation and utilization, synthesis and degradation are controlled primarily by covalent phosphorylation and allosteric ligand binding of the enzymes involved in glycogen metabolism. It is suggested that such enzymes are controlled by two enzymes, laforin and malin, which form a complex that is able to ubiquitinate those targets and target them for degradation, as a way of controlling glycogen synthesis. Mutations in the genes coding for these two proteins are the cause of Lafora disease, a type of myoclonic progressive epilepsy. Laforin is a unique human dual-specificity phosphatase (DSP), as it contains a carbohydrate binding module (CBM) at its N-terminal along with the Dual-Specificity Phosphatase Domain (DSPD) at its C-terminal, whereas malin is an E3 ubiquitin ligase of RING type. Malin was shown to interact with laforin within the region between the CBM and DSPD domains. Based on this, the aim of this work is the optimization of expression and purification of protein to obtain sufficient amounts of protein for further identification of a minimal laforin amino acid sequence required for the interaction with malin. To achieve this, several constructs coding for either the CBM or DSPD domains with increasing length of the inter-domain region were obtained by molecular biology techniques. The protein expression was performed using E. coli as host system, and the results have shown that, apart from the shorter CBM constructs, most protein is expressed in the form of insoluble inclusion bodies. The attempts to refold such proteins using the protocol previously developed for the refolding of laforin and its CBM proved unsuccessful. Laforin CBM domain was successfully expressed in soluble form and has been purified with a yield of 1,73 mg/L of expression media. Malin expression revealed that the protein is very poorly expressed in E. coli, being only detected by western-blot. Most of the protein was expressed as inclusion bodies, and despite some attempts to obtain soluble protein expression, no protein could be purified. This work has evidenced the difficulties of expressing protein domains and the importance of choosing the correct boundaries of such domains. Nevertheless, this work paves the way for the further optimization necessary for the expression and purification of both malin and the laforin constructs developed during this work.

O glicogénio consiste num polímero de glucose, solúvel e ramificado que se encontra presente no citoplasma celular e funciona como reserva energética. A acumulação e utilização, bem como a síntese e degradação são processos controlados pela regulação da atividade das enzimas envolvidas no metabolismo do glicogénio, por reações de fosforilação e interações alostéricas. Duas enzimas, a laforina e a malina, estão envolvidas nesta regulação enzimática. Formam um complexo que promove a ubiquitinação dos respectivos substratos e o seu direcionamento para degradação permitindo uma regulação da síntese do glicogénio. Mutações nos genes que codificam ambas as proteínas levam ao aparecimento da doença da Lafora que consiste num tipo de epilepsia mioclónica progressiva. A laforina é a única fosfatase de dupla especificidade (DSP) humana devido à presença de um respectivo domínio DSP no C-terminal apresentando também um módulo de ligação a carbohidratos (CBM) no N-terminal. Por sua vez, a malina é uma ligase de ubiquitina E3 do tipo RING finger e interage com a laforina na região entre os domínios CBM e DSPD. Com base nesta informação, o objectivo do projecto consistiu na optimização da expressão e purificação das proteínas de modo a obter quantidades suficientes para uma posterior identificação da região mínima da laforina necessária para interagir com a malina. Para isto, várias construções contendo quer o domínio CBM ou o domínio DSP com um aumento da sequência da região entre os domínios foram obtidas por técnicas de biologia molecular. A expressão de proteína foi feita utilizando a E. coli como sistema de expressão e de acordo com os resultados obtidos, à parte das construções mais curtas contendo o domínio CBM, a maior parte da proteína das restantes construções é expressa na forma de corpos de inclusão. Tentativas de refolding destas proteínas com base num protocolo previamente desenvolvido para expressão de laforina e do seu domínio CBM falharam. No entanto, o domínio CBM da laforina foi expresso na forma solúvel e purificado com um rendimento de 1,73 mg/L de meio de expressão. Relativamente à malina, os rendimentos de expressão em E. Coli são muito baixos no qual a proteína só é detectada em western-blot. A maior parte da proteína é expressa como corpos de inclusão e apesar de algumas tentativas no sentido de obter proteína solúvel, ainda assim não foi possível purificar a malina. Este trabalho mostra a dificuldade na expressão de domínios proteicos e na importância de uma escolha correcta dos limites destes domínios. No entanto, este trabalho abre caminho para futuras optimizações necessárias para a expressão e purificação da malina assim como das construções derivadas da laforina desenvolvidas ao longo deste trabalho.