Post-transcriptional mechanisms of regulation of AMPA receptors : regulation of GluA1 expression by the contactin associated protein 1

Abstract

No sistema nervoso central, a maior parte da neurotransmissão excitatória é mediada por receptores de glutamato do tipo AMPA que possuem papéis fundamentais na plasticidade sináptica, o fenómeno celular na base de processos de aprendizagem e memória. Modificações no tráfego destes receptores e na sua inserção ao nível das sinapses, bem como na estabilidade do RNA mensageiro das subunidades dos receptores ou no seu decaimento, são cruciais para induzir alterações de longo prazo na força e eficiência sinápticas, o que permite a expressão de mecanismos de plasticidade. Tendo isto em conta, torna-se particularmente importante compreender a fundo como é que estes eventos são regulados, de forma a desvendar os mecanismos que estão na base de várias formas de plasticidade. Um estudo recente realizado no nosso laboratório permitiu a identificação da proteína 1 associada à Contactina (Caspr1) como um novo interactor da subunidade GluA1 dos receptores AMPA. Esta proteína foi capaz de induzir um aumento nos níveis superficiais de GluA1, bem como mediar o seu endereçamento para a membrana sináptica. Para além disso, e duma maneira independente da transcrição, a Caspr1 foi capaz de induzir um aumento nos níveis de RNAm de GluA1, o que sugere um papel importante da Caspr1 na regulação da estabilidade destes transcriptos. Estas evidências propõem então a existência de um novo mecanismo de regulação pós-transcripcional dos receptores AMPA, desconhecido até agora. Ainda assim, o papel da Caspr1 na regulação da subunidade GluA1 está longe de ser compreendido, pelo que é importante continuar a caracterizar este mecanismo regulador. Neste trabalho procurámos, em primeiro lugar, confirmar o papel da Caspr1 na regulação da subunidade GluA1. A sobreexpressão da Caspr1, tanto num sistema heterólogo como em neurónios primários de hipocampo, resultou num aumento significativo nos níveis totais de GluA1. Para além disso, conseguimos identificar o domínio intracelular da Caspr1 rico em prolinas como sendo o responsável por estes efeitos nos níveis de GluA1. De facto, uma forma da Caspr1 sem o domínio rico em prolinas não teve qualquer efeito nos níveis totais de GluA1, em células COS7. Tendo em conta que o domínio rico em prolinas da Caspr1 é capaz de interagir com domínios SH3 de várias moléculas de sinalização, em particular com a tirosina cínase Src, colocámos a hipótese de o efeito da Caspr1 nos níveis de GluA1 ocorrer por activação, mediada pelo seu domínio de prolinas, de uma via de sinalização a jusante da Src. De facto, a expressão da Caspr1 em células COS7 foi capaz de induzir um grande aumento nos níveis de Src fosforilada, bem como nos níveis de ZBP1 (proteína 1 de ligação a ‘zipcodes’) fosforilada. Este alvo de fosforilação pela Src é uma proteína de ligação a RNAs, conhecida por regular a tradução de vários RNAm. Para além disso, a sobreexpressão da Caspr1 em neurónios de hipocampo induziu um aumento significativo e específico no número de agregados de Src e ZBP1 fosforiladas, ao nível da sinapse. Por fim, tentámos investigar quais os estímulos fisiológicos capazes de regular a expressão endógena da Caspr1. Um pormenor interessante é que o efeito que a Caspr1 exerce sobre os níveis da subunidade GluA1 assemelha-se bastante ao efeito induzido por um bloqueio crónico da actividade neuronal, bloqueio esse que induz um fenómeno de plasticidade homeostática que depende do aumento da expressão de receptores AMPA, numa tentativa de restituir os níveis de actividade neuronal. De acordo com isto, um bloqueio crónico da actividade neuronal induzido por TTX (bloqueador específico de canais de sódio dependentes de voltagem), foi capaz de promover um aumento significativo, não só nos níveis totais de GluA1, mas também nos níveis endógenos da Caspr1. Além disso, esta manipulação da actividade neuronal foi ainda capaz de induzir a activação da via de sinalização da Src, aumentando os níveis de Src e ZBP1 fosforiladas. Em conclusão, este estudo contribuiu para caracterizar os mecanismos moleculares envolvidos na sobrerregulação da subunidade GluA1 pela Caspr1, bem como para identificar estímulos fisiológicos com impacto nestes mecanismos. Por fim, este estudo propõe um papel promissor para a Caspr1 na regulação de mecanismos na base da plasticidade homeostática.

Fast excitatory synaptic transmission in the central nervous system is mediated by glutamate receptors of the AMPA-type, which play key roles in synaptic plasticity, the cellular correlate of learning and memory. Modulating the traffic and synaptic insertion of these receptors as well as their protein levels, e.g. through regulation of their mRNA stability and turnover, is crucial to induce long-term changes in synaptic strength and efficacy, which accounts for the expression of mechanisms of synaptic plasticity. Thus, understanding how these events are regulated is of major importance to fully unravel the mechanisms that underlie several forms of plasticity. Recent data from our laboratory identified the integral membrane protein Contactin associated protein 1 (Caspr1) as a novel interactor of the GluA1 subunit of AMPARs. This protein was able to increase the cell surface expression of GluA1 and also, mediate its traffic to the synaptic membrane. Moreover, Caspr1 presented an upregulatory effect in GluA1 mRNA levels, in a transcription-independent manner, which suggests a role for Caspr1 in the regulation of GluA1 mRNA stability. These evidences suggest a novel post-transcriptional regulatory mechanism of AMPARs, unknown until now. Thus, it became important to further characterize the regulation of the GluA1 AMPAR subunit by Caspr1. We firstly sought to confirm the role of Caspr1 in regulating the protein levels for the GluA1 subunit. Overexpression of Caspr1, both in a heterologous system and in cultured hippocampal neurons, resulted in a significant increase in the total levels of GluA1. Moreover, we identified the proline-rich region of Caspr1 as the molecular determinant responsible for its effect in GluA1 levels. Indeed, when expressing a construct specifically deleted for the proline-rich domain, Caspr1 failed to increase GluA1 total levels, in COS7 cells. Taking into account that the proline-rich domain of Caspr1 interacts with SH3 domains of various signaling molecules, particularly that of the tyrosine kinase Src, we hypothesized that the effect of Caspr1 in GluA1 levels occurs through a proline domainmediated activation of a signaling pathway downstream of Src. Expression of Caspr1 in COS7 cells resulted in a marked increase in levels of phosphorylated Src as well as phosphorylated levels of its downstream target, Zipcode binding protein 1 (ZBP1), a RNA-binding protein known to regulate mRNA translation upon Src-dependent phosphorylation. Moreover, overexpression of Caspr1 in hippocampal neurons was able to induce a specific increase in the number of both phosphorylated Src and ZBP1 puncta at the synaptic level. Furthermore, we sought to investigate physiological stimuli capable of regulating the endogenous expression of Caspr1. Interestingly, the upregulatory effect that Caspr1 exerts in levels of GluA1 subunit parallels that of chronically blocking neuronal activity, which results in a homeostatic synaptic scaling of GluA1. Accordingly, chronic blockade of activity induced by TTX, a blocker of voltage-gated sodium channels, was able to significantly increase not only GluA1 total levels, but also levels of endogenous Caspr1. Moreover, this manipulation of neuronal activity was able to induce an activation of the Src signaling pathway, with increases in phosphorylated levels of both Src and ZBP1. In conclusion, this study contributed to characterize the molecular mechanisms involved in the upregulation of the GluA1 subunit by Caspr1, as well as the physiological stimuli that impinge on those mechanisms. Moreover, it unveils a potentially promising role for Caspr1 in mediating homeostatic plasticity mechanisms.