Characterization of cancer stem-like properties in canine mammary cancer

Abstract

Um dos conceitos mais motivantes na área da Oncobiologia é a teoria das células estaminais tumorais (CSC), a qual defende que uma minoria de células transformadas, com propriedades estaminais, constituem a origem da renovação celular neoplásica, pelo que são determinantes no seu comportamento biológico. No cancro de mama canino (CMC) são poucos os estudos acerca da existência de CSC. No entanto, caso as células estaminais/progenitores sejam de facto o alvo da transformação neoplásica na glândula mamária canina, como foi proposto para o cancro de mama humano, a elucidação das vias moleculares que regulam a actividade das CSC e a sua interacção com o microambiente, fornecerá potenciais alvos terapêuticos para esta doença. Usando uma abordagem in vitro (três linhas celulares mamárias caninas), identificámos células com propriedades estaminais, através do ensaio de formação de mamosferas. Foi também realizada caracterização fenotípica por citometria de fluxo, imunofluorescência e western blot, assim como estudos funcionais. Foi ainda avaliada, pela técnica da imuno-­‐histoquímica, a expressão de marcadores de CSC (ALDH1, CD24, CD44) numa série de 112 casos de CMC. Os nossos resultados referentes às linhas celulares parecem refletir a heterogeneidade verificada nos tumores mamários caninos, visto apresentarem diferentes características fenotípicas e propriedades funcionais. No que diz respeito ao fenótipo estaminal, as linhas celulares apresentaram padrões de expressão diferentes. A citometria demonstrou que a linha CMT-­‐3p, a mais invasiva, apresentou enriquecimento no fenótipo CD44+/CD24low. Todas as linhas celulares apresentaram actividade da ALDH e foram capazes de crescer em condições independents de ancoragem, como esferóides, estando o fenótipo CD44+CD24-­‐ /lowALDH1+aparentemente relacionado com esta capacidade. Por outro lado, no nosso modelo in vitro, a transição epitelial-­‐mesenquimatosa não parece estar associada a características de células estaminais, uma vez que a linha celular que apresentou mais marcadores mesenquimais foi a que patenteou menos marcadores de CSC. No que diz respeito aos carcinomas mamários caninos, o CD44 (81,1%) foi o marcador observado mais frequentemente, sendo incomum nos carcinomas sólidos. O CD24 apresentou expressão rara, enquanto a expressão da ALDH1 foi observada frequentemente tanto nas células epiteliais como estromais. Não se observou qualquer associação entre o fenótipo CSC e um comportamento biológico mais agressivo. Pelo contrario, a expressão da ALDH1 encontrou-­‐se significativamente associada com melhor prognóstico. Os nossos resultados reforçam a teoria das CSC neste modelo animal; no entanto, consideramos essenciais estudos adicionais in vitro e in vivo no sentido de descortinar o seu significado biológico nesta complexa doença.

One of the most motivating concepts that is being explored in the human cancer research field is the cancer stem cell (CSC) hypothesis, which states that a minority of transformed cells, with acquired stem or progenitor properties, are the source of tumour cell renewal and thereby determine tumour behaviour. In canine mammary cancer (CMC), few studies have focused on the existence of cancer stem cells. If stem/progenitor cells are the targets for transforming events in canine mammary gland, as proposed for human breast cancer, the elucidation of the molecular pathways that regulate self-­‐renewal activity of cancer stem cells and their interaction with the microenvironmental niche will provide potential therapeutic targets for this disease. Through an in vitro approach (three mammary tumour cell lines), we have identified cells with stem-­‐like properties, by using a mammosphere formation assay. A phenotypical characterization by flow cytometry, immunofluorescence and western blot has also been performed, as well as functional assays. In addition, we have evaluated the immunohistochemical expression of CSC markers (ALDH1, CD24, CD44) in a series of 112 canine mammary carcinomas. Our results showed that these cell lines reflect the heterogeneity of canine mammary cancer, as they display different phenotypical characteristics as well as functional properties. With regard to CSC phenotype, cell lines exhibited distinct expression patterns. Flow cytometry showed that CMT-­‐3p, the most invasive cell line, was highly enriched for the CD44+/CD24low CSC phenotype. All cell lines presented ALDH activity and were able to grow as spheroids in anchorage-­‐independent conditions, with CD44+CD24-­‐/lowALDH1+ phenotype apparently related with this capacity. On the other hand, in our in vitro model, epithelial mesenchymal transition (EMT) was not necessarily associated with stem-­‐cell traits, given that CMT-­‐2p, the cell line that presented more mesenchymal markers, was the cell line that expressed less CSC markers. Concerning to canine mammary carcinomas, CD44 (81.1%) was the CSC marker most frequently observed, being rarely found in solid carcinoma subtype. CD24 was infrequent, while ALDH1 expression was frequently observed both in epithelial and stromal cells. No association was observed between CSC markers expression and aggressive tumour behaviour. In fact, a positive epithelia ALDH1 expression was significantly associated with better overall and disease-­‐free survival. Our results further consolidate the stem cell theory in this animal model; however, additional studies are required in order to unravel its biological significance in this complex disease.