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https://hdl.handle.net/10316/25140
Title: | Comparative study of the effect of selected mutations on alpha-synuclein oligomerization in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay | Authors: | Rodrigues, Eva Sofia Ferreira | Orientador: | Outeiro, Tiago Fleming Duarte, Emília |
Keywords: | Alfa-sinucleína; Complementação de fluorescência bimolecular; Oligomerização; Mutações | Issue Date: | 2012 | Place of publication or event: | Coimbra | Abstract: | A doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais comum
que afecta cerca de 2% da população acima dos 60 anos de idade. Patologicamente é
caracterizada pela perda progressiva de neurónios dopaminergicos na substantia nigra
e pela presença de inclusões proteicas designadas por corpos de Lewy. Os corpos de
Lewy são predominantemente compostos por fibrilhas de alfa-sinucleína. Várias
mutações genéticas têm sido identificadas e implicadas no começo e desenvolvimento
da DP. Mutações no gene da alfa-sinucleína são responsáveis por formas familiares
dominantes da DP, demonstrando um papel importante desta proteína na progressão
da neurodegeneração. Estudos mais recentes indicam que as espécies oligomericas de
alfa-sinucleína, possíveis espécies intermediárias que precedem à formação de
inclusões, são mais tóxicas que as espécies fibrilhares. No entanto, ainda pouco é
conhecido relativamente aos determinantes moleculares da oligomerização em
doenças neurodegenerativas. O estudo de interações proteína-proteína é crucial para
perceber os determinantes moleculares da oligomerização da alfa-sinucleína na DP
bem como a sua distribuição pela célula. Para este efeito neste estudo geramos
mutações pontuais na alfa-sinucleína e investigámos o seu comportamento em células
vivas através da técnica complementação de fluorescência bimolecular. Esta técnica
permite analizar in vivo a dimerização/oligomerização da proteína de interesse através
da reconstituição de fluorescência, permitindo-nos avaliar o efeito das mutações na
oligomerização, atravez do aumento ou diminuição de fluorescência. Os resultados
obtidos mostram que embora a maioria dos mutantes tenham mostrado um aumento
na formação de oligómeros comparando com a alfa-sinucleína wild-type, o maior
aumento de oligomerização foi observado precisamente nos mutantes conhecidos por
terem uma maior propensão para formar oligómeros e uma reduzida abilidade para
formar fibrilhas. Assim, o uso desta poderosa técnica permitir-nos-á investigar a
natureza das espécies oligoméricas de alfa-sinucleína na presença de várias mutações,
bem como conduzir aos mecanismos moleculares subjacentes à neurodegeneração.
Por último, este conhecimento será essencial para o desenvolvimento de novas
estratégias terapêuticas para intervenção na DP. Parkinson’s disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder affecting approximately 2% of the population over 60 years of age. Pathologically is characterized by the progressive loss of nigrostriatal dopaminergic neurons and the presence of protein inclusions termed Lewy bodies within dopaminergic neurons, which are predominantly composed of fibrillar alpha-synuclein (α-syn). Although several genetic mutations have been implicated in the onset of the disease, mutations in the α-syn gene are responsible for familial forms of PD demonstrating a crucial role for α-syn on the progression of neurodegeneration. Recently, it has been suggested that oligomers, possible intermediary species thought to precede fibrillar inclusions, are more toxic than the α-syn fibrils. However little is still known about the molecular determinants of oligomerization in neurodegenerative diseases. The study of proteinprotein interactions is crucial for understanding the molecular determinants of oligomerization in PD and their distribution throughout the cell. For this purpose we generated selected mutations on α-syn and investigated their behavior in living cells through bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay. Since the BiFC stabilizes the interaction between the protein of interest upon the reconstitution of the fluorescence moiety, it allowed us to determine whether the formation of oligomers by the selected mutations are increased or decreased compared with wild type (WT) α-syn. Although almost all the α-syn mutants showed an increase formation of oligomers compared with WT, the strongest increase of oligomerization was observed with α-syn mutants known to have an increased propensity to form oligomers and a reduced ability to form fibrils. Thus, the use of this powerful assay will allow us to investigate the nature of the α-syn oligomeric species and to shed light into the molecular mechanism underlying neurodegeneration. Ultimately, this knowledge will be essential for the development of novel therapeutic strategies for intervention in PD. |
Description: | Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular, apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra | URI: | https://hdl.handle.net/10316/25140 | Rights: | openAccess |
Appears in Collections: | UC - Dissertações de Mestrado FCTUC Ciências da Vida - Teses de Mestrado |
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