Leucine-Rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson’s Disease - a role in endocytosis of synaptic vesicles

Abstract

A doença de Parkinson (PD) é uma perturbação cerebral e prolongada que se caracteriza pelo inclusão de corpos de Lewy (LB) e pela degeneração dos neurónios dopaminérgicos da substância nigra pars compacta (SNpc) até ao estriado. É a segunda doença neurodegenerativa mais comum e tem como principais sintomas a dificuldade em controlar os movimentos voluntários, movimentos lentos, tremor, rigidez, instabilidade postural e demência. Actualmente, a patogênese da PD não está totalmente clarificada mas alguns estudos têm sugerido que o envelhecimento, factores ambientais e genéticos desempenham um papel preponderante para o desenvolvimento da doença. Mais recentemente, estudos genéticos têm descrito várias mutações no gene Leucine- Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) que causam PD do tipo autossómico dominante com início tardio sendo clinicamente impossível diferenciar da PD idiopática. De facto, as mutações no gene LRRK2 são responsáveis por 5-10% dos casos familiares e 1-2% dos casos esporádicos da PD. A proteína LRRK2 é uma ampla e complexa proteína com diversos domínios exibindo duas principais actividades enzimáticas, GTPase e cinase. A mutação mais conhecida, G2019S, leva ao aumento da actividade cinase, enquanto mutações no domínio GTPase, tal como R1441C/G, também afectam a actividade cinase. A função biológica/patológica da proteína LRRK2 permanece desconhecida, mas várias evidências descrevem que esta proteína desempenha papéis no encurtamento das dendrites, disfunção mitocondrial, tradução proteica, autofagia, libertação de neurotransmissores e na endocitose de vesículas sinápticas. De facto, a proteína LRRK2 tem sido descrita como uma proteína reguladora devido às suas interacções com elementos chave para o tráfego das vesículas sinápticas dentro da célula pré-sináptica tais como a proteína Rab5b, subunidades do complexo AP-2, glicoproteína 2A da vesícula sináptica (SV2A), NEM-sensitive factor (NSF) e a clathrin coat assembly protein, AP180. Neste projecto, culturas primárias de hipocampo de ratinhos Wild Type e LRRK2 Knockout foram estabelecidas para estudar, via whole-cell patch clamp, o papel da LRRK2 na reciclagem de vesículas sinápticas e na libertação de neurotransmissores. A ausência de LRRK2 e a inibição farmacológica da actividade cinase da proteína LRRK2 prejudica a libertação de neurotransmissores, ao nível da célula pré-sináptica, devido a perturbações na endocitose de vesículas sinápticas. Juntamente com estas observações, o nosso estudo mostra que existe uma conservação evolucionária desta função fisiológica em Drosophila melanogaster e em neurónios de mamíferos. Perante isto, a LRRK2 também regula, em neurónios de mamíferos, a endocitose de vesículas sinápticas na célula pré-sináptica através de um ciclo de fosforilação da endofilina.

Parkinson’s disease (PD), the second most common neurodegenerative disorder, is characterized by progressive degeneration of dopaminergic projections from the substantia nigra pars compacta (SNpc) to the striatum and presence of Lewy bodies (LBs). PD affects the control of voluntary movement leading to tremor, postural imbalance, rigidity, and slowness of movement, depression and dementia. The pathogenesis of PD is not fully understood but many studies have suggested that aging, environmental factors and genetic susceptibility play an important role. Human genetics has defined several mutations in the Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) gene as a cause of late-onset autosomal dominant PD that is clinically indistinguishable from idiopathic PD. LRRK2 mutations account for 5-10% of familial and 1– 2% of sporadic PD cases. LRRK2 is a large, complex, multidomain protein displaying kinase and GTPase enzymatic activities and multiple protein–protein interaction domains. The best characterized mutation, G2019S, leads to increased kinase activity, while mutations in the GTPase domain, such as R1441C/G, have been reported to influence kinase activity as well. The biological/ pathological function of LRRK2 remains to be established, but several lines of evidence describe a role in decreased neurite outgrowth, mitochondrial dysfunction, increased protein translation, altered synaptic vesicles endocytosis and autophagy. LRRK2 has been suggested as a regulatory protein by its interaction with key elements of synaptic vesicle trafficking within the recycling pool such as Rab5b, AP-2 complex subunits, synaptic vesicle glycoprotein 2A (SV2A), NEM-sensitive factor (NSF) and clathrin coat assembly protein AP180. In this project different primary neuronal cultures of Wild Type (WT) and LRRK2 Knockout (KO) mouse were established to study, via whole-cell patch clamp recordings, the role of LRRK2 in synaptic vesicle recycling and neurotransmitter release. The absence of LRRK2 and the pharmacologic inhibition of LRRK2 kinase activity impair the neurotransmission, at level of pre-synaptic cell by disrupting the endocytosis of synaptic vesicles. Together, our work shows that there is evolutionary conservation of this previously identified physiologic function of LRRK2 from fly to mammalian neurons. Also in mammalian neurons, LRRK2 regulates the endocytosis of synaptic vesicles in the presynaptic cell, via an endophilin phosphorylation cycle.