Ensaios de cultura in vitro e poliploidização de Lavandula multifida L. e Lavandula viridis L’Her L.

Abstract

O género Lavandula é constituído por plantas aromático-medicinais com elevado interesse económico devido essencialmente à produção de óleos essenciais. A crescente procura de produtos naturais justifica o aumento da produção das respetivas plantas, recorrendo à cultura in vitro e prevenindo, assim, a colheita abusiva das espécies vegetais. Deste modo, a otimização de técnicas de micropropagação e o desenvolvimento de protocolos de melhoramento das espécies relevantes são fundamentais para a exploração do seu potencial. Como parte integrante de trabalhos em curso sobre a valorização das lavândulas portuguesas, pretende-se agora melhorar a produção de óleos essenciais de Lavandula multifida e Lavandula viridis, através da indução de poliploidia. Segmentos nodais de L. multifida e L. viridis obtidos de plântulas estabelecidas in vitro, foram sub-cultivados em meio MS (Murashige and Skoog, 1962), suplementado com colquicina 125 mg/L e 1% (v/v) de DMSO por 5 dias no escuro, a 24ºC. Após este tratamento, os meristemas axilares foram transferidos para meio MS suplementado com 0,2 mg/L de BAP e mantidos sob um fotoperíodo de 16h a 24ºC. O nível de ploidia das plântulas tratadas foi monitorizado por citometria de fluxo e confirmado por microscopia eletrónica de varrimento (SEM) e contagem do número de cloroplastos presentes nas células estomáticas da epiderme foliar. As plântulas com a ploidia desejada, mixoploidia ou tetraploidia, e plântulas controlo (não sujeitas ao tratamento com colquicina) foram transferidas para terra e aclimatadas. Por último, foram efetuados ensaios de embriogénese somática, com diferentes combinações de hormonas e concentrações, com o objetivo de induzir a formação de embriões somáticos a partir de explantes foliares de L. multifida. Em L. multifida obteve-se uma planta mixoplóide, sendo que a indução de tetraploidia ocorreu unicamente em L. viridis, obtendo-se 2 plantas tetraplóides e uma mixoplóide, que tiveram um bom desenvolvimento após a transferência para terra. Estes resultados foram comprovados por análises de citometria de fluxo, por observações em SEM onde se detetaram diferenças no tamanho dos tricomas glandulares peltados (em L. multifida) e nos tricomas glandulares peltados e tricomas glandulares capitados tipo II (em L. viridis) e por contagem do número de cloroplastos, onde se verificaram diferenças significativas entre o número de cloroplastos presentes em plantas diplóides, tetraplóides e mixoplóides Na indução de embriões somáticos, foi observada uma elevada percentagem de tecido caloso não embriogénico e a presença de estruturas globulares com potencial embriogénico, no meio MS suplementado com 2 mg/L 2,4-D + 0,5 mg/L cinetina. O presente trabalho fornece, pela primeira vez, avanços relevantes no melhoramento de L. multifida e L. viridis, sendo que ainda são necessários mais esforços para aumentar o número de plantas tetraplóides obtidas. Trabalhos futuros incidirão sobre a multiplicação dos tetraplóides obtidos e a comparação do rendimento e composição química dos óleos essenciais produzidos com os das plantas diplóides.

The genus Lavandula comprises aromatic and medicinal plants with high economic interest due essentially to the production of essential oils. The growing demand for natural products justifies the increase of plant production, thus avoiding spontaneous plant harvest and consequent dilapidation of natural resources. In vitro culture techniques that allow the production of higher oil-yielding plants are a key to exploiting the potential of these species. As part of our ongoing studies on the valorization of Portuguese lavenders we now intend to improve the production of Lavandula multifida and L. viridis essential oils, by inducing polyploidy. Nodal segments from plantlets of L. multifida and L. viridis were cultured on MS (Murashige and Skoog, 1962) medium supplemented with 125 mg/L colchicine and 1% (v/v) DMSO for 5 days in the dark, at 24ºC. After this treatment, axillary meristems were transferred to MS medium with 0.2 mg/L BAP under a photoperiod of 16h at 24ºC. The ploidy level of the treated plantlets was monitored by flow cytometry and confirmed by scanning electron microscopy (SEM) observations and chloroplast counting in the guard cells of leaf epidermis. Plantlets with the desired ploidy, mixoploids or tetraploids, and controls were transferred to soil and acclimatized. Attempts to induce somatic embryogenesis in young leaves were also carried out in L. multifida, with different combinations and concentrations of hormones. In L. multifida a mixoploid plant was obtained, and the induction of tetraploidy occurred only in L. viridis, yielding 2 mixoploid and tetraploid plants, which showed normal growth after transfer to soil. These results were confirmed by flow cytometry analysis, by SEM observations on the size of glandular peltate trichomes (in L. multifida) and glandular peltate trichomes and glandular capitate type II trichomes (in L. viridis) and counting of chloroplasts where significant differences were found among plants of different polidy levels. Regarding somatic embryogenesis, a large percentage of non-embryogenic callus tissue and some globular structures with embryogenic potential were obtained on MS medium supplemented with 2 mg/L 2,4-D and 0.5 mg/L kinetin. This study gave significant insights for the breeding of these species. However, more efforts need to be performed to increase the number of tetraploid plantlets. Further experiments will focus on the multiplication of tetraploid plants for essential oils extractions in order to compare their yield and chemical composition with those of diploid plants.