Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/24894
Title: Localization of secretases involved in the processing of β- Amyloid precursor protein related to alzheimer’s disease
Authors: Pliássova, Anna Vladímirovna 
Orientador: Agostinho, Paula
Tomé, Ângelo
Keywords: Sinapses; Doença de Alzheimer; ADAM10; Presenilina 1; BACE1
Issue Date: 2013
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: As fases iniciais da doença de Alzheimer são caracterizadas por alterações na eficiência sináptica, que se pensa serem causadas por oligómeros solúveis dos peptídeos β-amilóide (Aβ). Estes peptídeos são formados a partir da clivagem proteolítica da proteína precursora β-amilóide (APP), através da ação de secretases (α- e β-). Apesar de se saber que a formação de Aβ a nível sináptico é provavelmente crucial para o dano inicialmente verificado na doença de Alzheimer, a distribuição da APP e das secretases (α- β- e γ-) envolvidas no seu processamento proteolítico, em diferentes terminais nervosos, permanece desconhecida. Não se sabe ainda por que razão apenas alguns tipos específicos de sinapses sofrem degeneração nas fases iniciais da doença. É ainda mais surpreendente o facto de não ser conhecida a distribuição a nível sináptico e subsináptico da APP e das secretases, em diferentes tipos de terminais nervosos, em diversas regiões cerebrais, bem como o facto de se desconhecer se esta distribuição sofre alterações em modelos animais da patologia de Alzheimer. Os principais objetivos deste trabalho eram: i) investigar a distribuição sináptica e sub-sináptica (zonas pré-, pós- e extra-sinápticas) da APP e das secretases (α- β- e γ-), com particular foco no hipocampo, ii) definir a presença de APP e das secretases, bem como a sua co-localização em diferentes tipos de terminais nervosos, principalmente glutamatérgicos e GABAérgicos e iii) investigar se a idade e condições de doença de Alzheimer afectam a distribuição da APP e das secretases em terminais nervosos. A distribuição sináptica e a densidade da APP, da BACE1 (β-secretase), da ADAM-10 (α- secretase) e da presenilina -1 (PS1, um componente da γ-secretase) foram avaliadas por Western blot e imunocitoquímica, em preparações sinápticas de hipocampo (sinaptossomas e terminais nervosos purificados), que foram obtidas a partir de murganhos machos adultos C57/Bl6, com 2-3 meses de idade, a partir de murganhos do mesmo tipo, com 9 meses de idade, e também a partir de murganhos triplos transgénicos modelos da doença de Alzheimer. Recorrendo a um protocolo de fracionamento sináptico, que permite a separação das fracções pré-, pós- e extrasinápticas, avaliámos ainda a distribuição sub-sináptica relativa da APP e das secretases. Além disso, fizemos também um estudo preliminar para determinar os níveis de APP em amostras de cérebro humano de indivíduos com diferentes idades. No hipocampo de murganhos jovens adultos (2-3 meses), através da comparação das imunoreactividades da APP e das secretases em sinaptossomas (terminais nervosos) e membranas totais, verificámos que a APP, a α- e a β-secretases se encontram presentes em terminais nervosos, apesar de não estarem enriquecidas nos sinaptossomas. Também observámos que a APP está localizada preferencialmente a nível pré-sináptico, a α- secretase (ADAM10) se encontra distribuída pré- e extra-sinapticamente, ao passo que a β-secretase (BACE1) se encontra principalmente na fração extra-sináptica. Através de análise imunocitoquímica, em terminais pré-sinápticos do hipocampo, purificados e plaqueados, verificamos que a APP é mais abundante do que as secretases (ADAM10, BACE1 e presenilina1, PS1), que a APP e a BACE1 estão parcialmente co-localizadas em cerca de 40% e ainda que esta secretase se encontra mais presente nos terminais glutamatérgicos do que nos GABAérgicos. Inesperadamente, não observamos diferenças significativas na densidade da APP e das α- e β-secretases, nos sinaptossomas de hipocampo de murganhos adultos (9 meses de idade), em comparação com murganhos jovens adultos (2-3 meses de idade). Por outro lado, em amostras de cérebro humano verificámos uma clara diminuição da densidade da APP com o aumento da idade (resultados preliminares). Em murganhos triplos transgénicos modelos da doença Alzheimer, observámos uma clara diminuição da imunoreactividade da ADAM10, bem como um aumento da PS1, por análise de imunocitoquímica. Os resultados apresentados neste estudo representam a primeira análise comparativa das distribuições sináptica e sub-sináptica da APP e das secretases, em regiões corticais (principalmente do hipocampo) do cérebro de murganhos, bem como da avaliação da abundância relativa da APP e das secretases e da sua co-localização, em diferentes terminais nervosos de hipocampo. Foi também avaliada a existência de alterações relacionadas com a idade e com a doença de Alzheimer no que diz respeito à densidade da APP e das secretases. Este projeto constitui o primeiro passo para a compreensão da particular susceptibilidade para a disfunção e degeneração de sinapses glutamatérgicas e GABAérgicas, em etapas iniciais da doença de Alzheimer, e pode vir a ser útil para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.
The early stages of Alzheimer´s disease (AD) are associated with alterations in synaptic efficiency, which are thought to be caused by oligomeric assemblies of soluble β-amyloid peptides (Aβ). Aβ are derived from the proteolytic cleavage of the amyloid precursor protein (APP) through the action of secretases Although it is widely accepted that synaptic Aβ formation is likely crucial for AD initial damage, the distribution of APP and secretases which mediate APP proteolytic processing (α- and β-) in different nerve terminals remains to be clarified. It is still not known why only some particular synapses begin degenerating in early AD. In fact, it is surprising to note that the synaptic and subsynaptic distribution of APP and secretases across different types of nerve terminals in different brain regions is unknown, nor is it known if their distribution changes in animal models of AD. The main goals of this study were: to i) to investigate the synaptic and subsynaptic (pre-, post- and extra-synaptic zones) distribution of APP and secretases (α- β- and γ-) with a particular focus on the hippocampus, ii) to define the presence of APP and secretases and their co-localization in different types of nerve terminals, mainly glutamatergic and GABAergic terminals and iii) to investigate whether the age and AD condition affect the distribution of APP and secretases in nerve terminals. The synaptic distribution and density of APP, BACE1 (β-secretase), ADAM-10 (α-secretase) and presenilin -1 (PS1, a component of γ-secretase) were assessed through Western blot and immunocytochemical analyses in hippocampal synaptic preparations (synaptosomes and purified presynaptic terminals) obtained from adult male C57/Bl6 mice with 2-3 months old or 9 months old, and in a triple transgenic mice model of AD (3xTg-AD). Using a procedure of synaptic fractioning, which allows the separation of pre-, post- and nonsynaptic (extrasynaptic) fractions we have also evaluated the relative subsynaptic distribution of APP and secretases. Moreover, we also perform a preliminary study to determine the levels of APP in cortical human samples from individuals with different ages. In hippocampus of young adult mice (2-3 months), by comparing the immunoreactivities of APP and secretases in synaptosomes (nerve terminals) and total membranes, it was found that APP, α- and β-secretases are present in nerve terminals, IX albeit they were not enriched in synaptosomes. It was also observed that APP was mainly located presynaptically, the α-secretase (ADAM10) was distributed pre- and extrasynaptically, whereas β-secretase (BACE1) was preferentially located in the extrasynaptic fraction. Through immunocytochemistry analysis, in platted purified hippocampal presynaptic nerve terminals, we observed that APP was more abundant than secretases (ADAM10, BACE1 and Presenilin1) in nerve terminals and also that APP and BACE 1 are partially co-localized by about 40%, and this secretase is present in higher levels in glutamatergic than in GABAergic terminals. Unexpectedly, no significant differences were observed in the density of APP and α- and β-secretases in hippocampal synaptosomes of adult mice (9 months old as compared to young adult mice (2 months old), whereas in cortical human brain it seems to occur a reduction of APP density with the advance of age (preliminary data). In triple transgenic AD model mice, we observed a clear decrease in ADAM 10 immunoreactivity, as well as an increase of PS1 in immunocytochemical analysis. The results present in this study provide the first comparative analysis of synaptic and subsynaptic distribution of APP and secretases in cortical brain regions of mice mainly in hippocampus; and the assessment of the relative abundance of APP and secretases and their co-localization in different hippocampal nerve terminals. Age- and AD pathology-related changes in APP and secretases were also investigated. This provides a first step to understand the particular susceptibility to dysfunction and degeneration of glutamatergic and GABAergic synapses in early AD, and might be useful to the development of novel therapeutic strategies
Description: Dissertação de mestrado em Bioquímica, apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
URI: http://hdl.handle.net/10316/24894
Rights: openAccess
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