Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/24731
Title: Bacterial protein azurin as a new candidate anticancer drug by decreasing cell adhesion through integrins
Authors: Abreu, Sofia de Almeida Santos de Castro e 
Orientador: Alpoim, Carmen Maria Martins de Carvalho
Fialho, Arsénio do Carmo Sales Mendes
Keywords: Adesão; Azurina; Cancro de mama; Cancro de pulmão; Integrina; P-caderina
Issue Date: 2013
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: A azurina é uma proteína de 14 kDa produzida por Pseudomonas aeruginosa, com actividade citotóxica em linhas celulares cancerígenas humanas. A azurina entra preferencialmente em células cancerígenas, formando um complexo com a proteína supressora tumoral p53, estabilizando-a e induzindo a apoptose. A capacidade de migração e invasão deve-se, em parte, à regulação de proteínas de adesão celular, como a P-caderina. A Pcaderina é sobre-expressa em 30% dos cancros de mama e é um marcador de mau prognóstico. Por isso, a P-caderina é um potencial alvo terapêutico em cancro de mama. Por essa razão, a capacidade da azurina diminuir esta proteína em modelos de cancro de mama que sobre-expressam P-caderina foi testada, verificando-se que a azurina diminui a sua expressão proteica e localização membranar. No entanto, o mecanismo de acção da azurina não é ainda bem conhecido. Por outro lado, o cancro do pulmão tem vias de sinalização semelhantes associadas à adesão celular, e por isso, este trabalho também se foca no impacto da azurina no cancro de pulmão. Não se sabe muito sobre como o microambiente estromal em locais de metástase fornece um ambiente adequado para as células tumorais. É por isso importante estudar a interação entre células metastáticas e o meio extracelular. Diferentes linhas celulares de cancro de mama com níveis distintos de expressão de Pcaderina e diferentes capacidades invasivas (MCF-7/AZ.Mock, MCF-7/AZ.Pcad, SUM149, BT- 20) e de cancro do pulmão (A549) foram tratadas com azurina (50μM e 100μM). O efeito de azurina na adesão celular com diferentes componentes do meio extracelular (laminina-332, colagénio do tipo-I, fibronectina e colagénio do tipo-IV) foi investigado, bem como a expressão de subunidades de integrina (α6, β1 e β4) por western blot. Os efeitos da azurina também foram avaliados por outros parâmetros, tais como a medição de ROS, imunocitoquímica, zimografia de gelatina de modo a avaliar a actividade da MMP-2 e a capacidade de invasão. A azurina diminui a expressão das subunidades de integrina (α6, β1 e β4) em todos os modelos estudados (cancro de mama e de pulmão), de forma mais consistente na subunidade de integrina β1. Além disso, a azurina diminui a adesão celular a componentes da matriz extracelular, principalmente em colagénio e laminina (cancro da mama) e fibronectina (cancro de pulmão), os componentes principais de cada tipo de cancro. Em BT-20 e A549, a azurina diminui a actividade da MMP-2 e, consequentemente, a capacidade de invasão. Estes resultados confirmam a azurina como um potencial fármaco terapêutico no cancro.
Azurin is a 14 kDa protein produced by Pseudomonas aeruginosa which has cytotoxicity activity towards human cancer cell lines. Azurin can enter preferentially into cancer cells, forming a complex with the tumour suppressor p53, stabilizing it and inducing apoptosis. The capacity of migration and invasion is due, in part, to the regulation of adhesion proteins, like Pcadherin. P-cadherin is over-expressed in 30% of breast cancers and it is a marker of poor survival. Therefore, P-cadherin is a potential therapeutic target in breast cancer. For that reason, azurin was used to target P-cadherin, decreasing its level in P-cadherin over-expressing breast cancer models and membranar localisation. However, the mechanism of action of azurin is not well known. On the other hand, lung cancer has similar signalling pathways associated with adhesion, and therefore, this work also focuses on the impact of azurin in lung cancer. Not much is known about how the stromal microenvironment at metastasis sites provides a suitable home to tumour cells. It is important to study the interaction between metastatic cells and ECM. We treated different cancer cells models with azurin (50 μM and 100 μM): four breast cancer cell lines with distinct levels of P-cadherin expression and different invasive capacities (MCF- 7/AZ.Mock, MCF-7/AZ.Pcad, SUM149 and BT-20) and one non-small cell lung cancer cell line (A549). We investigated the effect of azurin in cell adhesion with different ECM components (laminin-332, collagen type-I, fibronectin and collagen type-IV) and we also investigated integrin subunits (α6, β1 and β4) expression by western blot. The azurin effects were also evaluated by others parameters, such as ROS measurement, immunocytochemistry, gelatine zymography to evaluate MMP-2 activity and invasion capacity. Azurin decreased integrin subunits (α6, β1 and β4) in all studied models (breast and lung cancer), more consistently in the integrin subunit β1. Moreover, azurin decreased adhesion to ECM components, with more significance in collagen and laminin (breast cancer) and fibronectin (lung cancer), both main components in each cancer type. In BT-20 and A549, azurin decreased MMP-2 activity and the invasion through MatrigelTM. All these results corroborate azurin as potential cancer therapeutic drug.
Description: Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular,apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
URI: http://hdl.handle.net/10316/24731
Rights: openAccess
Appears in Collections:FCTUC Ciências da Vida - Teses de Mestrado

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