Role of miR-21 in the regulation of microglia immune response to glioma

Abstract

As células da microglia constituem as células imunes endógenas do sistema nervoso central. Estas células têm um papel importante na defesa do parenquima cerebral contra infecções, traumas, neurodegeneração e tumores cerebrais (tal como o glioma). Vários estudos mostraram que as células de glioma conseguem modular a resposta imunitária mediada pela microglia de maneira a promover a proliferação tumoral. No entanto, os mecanismos subjacentes a esta modulação ainda não se encontram totalmente esclarecidos. Vários miRNAs, como o miR-21 e o miR-155, foram reportados estarem sobreexpressos após activação das células da microglia e desempenharem um papel importante na regulação da resposta imunitária. De forma a entender como é que a resposta imunitária mediada pela microglia pode ser modulada pelas células de glioma, células de microglia da linha celular N9 foram incubadas com meio condicionado proveniente de células GL261 de glioma de ratinho, tendo-se avaliado alterações em vários mediadores pró-inflamatórios. Observou-se uma resposta imunitária caracterizada por um aumento dos níveis de RNAm das citoquinas pro-inflamatórias IL-1β e TNF- α, acompanhado de aumentos na expressão do RNAm da iNOS e na produção de óxido nítrico. Foram ainda observados aumentos na expressão de miR-21 e de miR-155. De maneira a tentar perceber em que medida o miR-21 estaria envolvido na regulação da resposta imunitária mediada pela microglia, procedeu-se à transdução das células N9 usando um vector lentiviral codificando um “short-hairpin” contra a sequência madura do miR-21). Este vector conferiu também às células a capacidade expressarem GFP, sendo assim gerada uma linha celular de microglia capaz de expressaando GFP e baixos níevis de miR-21 (N9 21). Como controlo, foi utilizado um vector lentiviral que codificando apenas GFP, gerando-se assim uma linha celular controlo que apenas expressava GFP (N9 GFP). Após o silenciamento do miR-21 na microglia, observou-se uma diminuição na produção da citocina pro-inflamatória IL-6 e de NO nestas células, o que sugere que o miR-21 é importante para uma resposta imunitária normal da microglia. Resultados semelhantes foram observados usando uma estratégia de transfecção não viral para entregar oligonucleótidos anti-niR-21 às células a fim de silenciar o miR-21 (silenciamento por transfecção com lipoplexos DLS). Finalmente, de forma a avaliar em que medida a activação da microglia afecta a proliferação das células de glioma, este tipo de células tumorais foi incubado com meio condicionado das células da microglia. Surpreendentemente, a incubação das células de glioma com meio condicionado proveniente de células da microglia em que o miR-21 foi silenciado, resultou num aumento de morte celular por apoptose. No seu conjunto, os nossos resultados sugerem que o miR-21 não só é importante para a resposta imunitária mediada pela microglia, como também o seu silenciamento na microglia parece potenciar a morte das células tumorais de glioma

Microglia cells are the endogenous immune cells of the central nervous system. These cells play an important role in the defense of brain parenchyma against infectious diseases, trauma, neurodegeneration and brain tumors (such as glioma). It has been reported that glioma cells modulate microglia-mediated immune response in order to promote tumor proliferation. However, the mechanisms underlying such modulation are not yet completely clear. Several miRNAs, such as miR-21 and miR-155, have been reported has being overexpressed after immune activation of microglia and to be involved in the regulation of the immune response. In order to clarify how microglia-mediated immune response may be modulated by glioma cells, N9 microglia cells were incubated with glioma-conditioned medium, derived from GL261 mouse glioma cells, and evaluated the changes in the production of pro-inflammatory mediators. We observed an immune response, characterized by an increase in the mRNA levels of IL-1β and TNF-α (two pro-inflammatory cytokines) along with an increase of the expression of iNOS mRNA and nitric oxide production. Moreover, an increase in the expression miR-21 and miR-155 was observed. In order to unravel the role of miR-21 in the regulation of microglia immune response, N9 microglia cells were transduced with a lentiviral vector encoding a short-hairpin sequence against the mature form of miR-21 (anti-miR-21 lentivirus). This lentiviral vector also provides the cells with the ability to express GFP and, thus using this strategy, we generated N9 cells expressing GFP and low levels of miR-21 (N9 21). N9 cells transduced with a lentiviral vector encoding only GFP were used as control cells (N9 GFP). Following miR-21 silencing, we observed a decrease in the production of the pro-inflammatory cytokine IL-6 and a dramatic decrease in NO production, which suggests that this miRNA is required for a normal microglia-mediated immune response. A non-viral strategy was also employed to silence miR-21 in microglia, which involved the delivery of anti-miR-21 oligonucleotides to N9 microglia cells through DLS lipoplexes. Similar results were obtained with lentiviral- and DLS-mediated miR-21 silencing. Finally, to evaluate whether microglial activation would affect glioma cell proliferation, glioma cells were exposed to conditioned medium produced by N9 cells. Surprisingly, silencing of miR- 21 in microglia enhanced glioma cell death through apoptosis when glioma cells were exposed to conditioned medium derived from N9 21 cells. Overall, our findings suggest that miR-21 plays an important role in microglia-mediated immune response, and that the silencing of this miRNA in microglia can contribute to glioma cell death through apoptosis.