MiRNA contribution to APP metabolism and Aβ production in Alzheimer’s disease: Identification of new miRNA-related SNPs in the 3’UTR of human APP and ApoE genes

Abstract

A doença de Alzheimer é uma patologia neurodegenerativa grave, caracterizada pela acumulação extracelular de placas do péptido β-amilóide e por uma fosforilação excessiva da proteína Tau. Ambos estes factores aparentam estar intimamente relacionados com a perda neuronal e inflamação que são verificadas nesta doença. Apesar de a doença de Alzheimer poder ser considerada uma doença esporádica, associada ao envelhecimento, uma pequena percentagem dos casos diagnosticados estão associados a mutações ou duplicações de genes específicos, dando ênfase à importância que a desregulação da expressão proteica pode desempenhar nesta patologia. Os microRNAs sao pequenos RNAs não codificantes que regulam a expressão génica ao nível pós-transcripcional, sendo assim fundamentais para o desempenho eficaz das funções celulares. Estudos do perfil de microRNAs, no contexto da doença de Alzheimer, permitiram indentificar vários microRNAs implicados na regulação de genes envolvidos no desencadeamento da cascata amiloidogénica (tais como os genes da APP, BACE1 e MAPT), reforçando a ideia de que os microRNAs podem contribuir para a progressão desta doença. O prsente estudo procura esclarecer o papel dos microRNAs como reguladores póstranscripcionais na doença de Alzheimer, avaliando de que forma a presença de polimorfismos na sequência de nucleótidos da região 3’UTR de dois genes implicados nesta doença (APP e ApoE) pode influenciar a ligação de microRNAs a esta região e, consequentemente, afectar a expressão destes mesmos genes. Usando uma técnica de sequenciação baseada no método de Sanger, identificámos e validámos a presença de um polimorfismo heterozigótico na região 3’UTR do gene da APP, que pode contribuir para incidência e desenvolvimento da doença de Alzheimer. Os nossos resultados sugerem que a presença deste polimorfismo pode interferir com a ligação de vários microRNAs ao RNA mensageiro da APP, promovendo assim a produção do peptídeo precursor amilóide e aumentando a deposição de placas senis no tecido nervoso. Através de um ensaio baseado na expressão de luciferase, demonstrámos também que o microRNA-485-5p é capaz de regular a expressão da APP através da ligação á região 3’UTR do RNA mensageiro, validando assim o RNA mensageiro desta proteína, validando-a assim como um alvo directo deste microRNA. Em conjunto, estes resultados realçam os efeitos que as variações genéticas relacionadas com os microRNAs podem causar na incidência e desenvolvimento da doença de Alzheimer e sugerem que o microRNA-485-5p pode providenciar um novo e interessante alvo terapêutico para esta doença.

Alzheimer’s disease (AD) is a severe neurodegenerative disorder, characterized by the accumulation of β-amyloid plaques in the extracellular space and an excessive phosphorilation of neuronal Tau. Both these factors are believed to be intimately related with the neuronal loss and inflammation observed in this pathology. Although AD can be considered a sporadic disease associated with the aging process, a small percentage of AD cases have been associated with specific gene mutations and/or duplications, emphasizing the importance of the deregulation of protein expression in this pathology. MicroRNAs are conserved small non-coding RNAs that control gene expression at the posttranscriptional level and are, thus, essential to ensure proper cellular function. Alzheimer’s disease profiling experiments have shown that several microRNAs are implicated in the regulation of key genes involved in the amyloidogenic pathway (such as APP, BACE1 and MAPT), suggesting that miRNA deregulation can contribute to the progression of this disease The present study aims to unravel the role of microRNAs as posttranscriptional regulators in AD, evaluating how single nucleotide polymorphisms (SNPs) present in the 3’UTR of two ADrelated genes (APP and ApoE) can influence miRNA binding and, consequently, APP and ApoE expression. Using a gene sequencing technique based on the Sanger method, we were able to identify and validate a heterozygous SNP in the 3’UTR region of the APP gene, which may contribute to AD onset and development. Our results suggest that the presence of this SNP can interfere with the binding of several miRNAs to the mRNA of APP, promoting APP upregulation and the consequent increase of Aβ deposition in the nervous tissue. In addition, using a luciferase-based assay, we were able to provide evidence that miRNA-485-5p is capable of regulating APP expression at the posttranscriptional level, by binding to the 3’UTR of APP mRNA, thus validating APP as a direct target of this miRNA.. Taken together, our results highlighted the effects of miRNA-related genetic variations in the etiopathology of AD and suggest that miRNA-485-5p can be a new and interesting therapeutic target for this disease.