Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/24646
Title: Bacterial retropepsin-like proteases : the evidence from Legionella pneumophila
Authors: Teixeira, Paulo Alexandre Gonçalves 
Orientador: Pires, Euclides
Simões, Isaura
Keywords: Aspartic Protease; Bacteria; Legionella pneumophila; Retropepsin
Issue Date: 2013
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: A2 family of aspartic proteases harbors mostly proteases found in retroviruses – the retropepsins. The evolution theories regarding these proteases usually state that these proteins are related to pepsin-like proteases from family A1 by two different hypotheses. By the first (and usually most accepted) theory, upon infection of a eukaryote cell by a retrovirus, the retropepsin gene would have integrated into the host’s genome and undergone a gene duplication and fusion event, giving rise to the first pepsin-like protease. The second theory would be that upon a virus infection of a eukaryote cell, half of a pepsin gene would be accidentally captured by the virus, evolving and creating the first retropepsin-like protease. Both theories neglected the possibility that these enzymes would exist in prokaryotes. Recently, through bioinformatics, several putative retropepsin-like and pepsin-like protease sequences have been found in prokaryotes, which challenge the evolutionary theories presented so far. In fact, it has already been experimentally proved the existence of the first pepsin-like protease in a prokaryote (shewasin A) and successfully characterized as an active aspartic protease. For this matter, the experimental validation regarding the existence of retropepsin-like aspartic proteases in prokaryotes needs to be addressed. Studies in our lab have already experimentally demonstrated the presence in Rickettsia of a highly conserved active aspartic protease with retropepsin-like signatures and features. However, this protease may not be the only one: bioinformatics analysis showed the existence of a large group of genes related to the Rickettsia retropepsinlike protease in several distinct prokaryote families, all revealing conserved retropepsin-like sequence features but with some interesting differences between them. The peculiar intracellular pathogen Legionella pneumophila is one of the several bacteria species in which a retropepsin-like sequence can be found. In this study, the putative soluble domain from the retropepsin-like protease sequence from the L. pneumophila genome has been cloned and expressed in E. coli. The protein’s soluble domain, termed LegRPsd, was characterized in terms of its enzymatic activity and XII oligomerization states. The LegRPsd protein has been proved an active enzyme, with our results pointing towards its inclusion as new member of the aspartic protease family. This protein showed proteolytic activity towards a peptide usually used as a typical substrate for aspartic proteases at an optimum pH of 4.0 and the activity is inhibited by about 50% by the aspartic protease inhibitor pepstatin A. LegRPsd was also proved to undergo auto-processing in a similar way as other retropepsin-like proteases, maturating into a form that is no longer inhibited by pepstatin A but strongly inhibited by specific inhibitors of HIV-1 retropepsin. The protein also showed other characteristics close to retropepsins, like the formation of a weak homodimer structure, thought to be needed for the formation of the active center and therefore, fundamental for activity. Moreover, protease activity was shown to be impaired by mutation of the putative catalytic aspartate. Altogether, these results provide strong experimental evidences regarding the existence of an active protease in L. pneumophila close to retropepsins not only in terms of sequence-structure homology, but also by its biochemical properties. This information becomes most valuable because LegRP, together with the Rickettsia aspartic protease, stands as a strong evidence of a novel family of aspartic proteases conserved in prokaryotes and related to retropepsins; this brings a redefinition of evolutionary theories regarding pepsins and retropepsins, suggesting a new point of view where these prokaryotic sequences represent the most ancestral state of retropepsins. Not least important is that the discovery of a conserved aspartic protease in L. pneumophila and other pathogenic bacteria raises the possibility of finding new pathogenic pathways and consequently new therapeutic targets for these difficult-to-treat infections as an alternative to the conventional antibiotics.
A familia A2 de proteases aspárticas é constituida maioritariamente por proteases encontradas em retrovírus – as retropepsinas. As teorias evolutivas inerentes a estas proteases normalmente referem que estarão relacionadas com proteases do tipo pepsina pertencentes à familia A1 de proteases aspárticas. Pela primeira teoria (geralmente a mais aceite), durante a infeção de uma célula eucariota por um retrovírus, o gene da retropepsina terá sofrido duplicação e fusão dando origem à primeira protease do tipo pepsina. A segunda teoria é defende que após a infeção de uma célula eucariota por um vírus, metade do gene de uma protease do tipo pepsina terá sido acidentalmente capturada pelo vírus, evoluindo e criando a primeira enzima do tipo retropepsina. No entanto, ambas as teorias negligenciam a possibilidade de que estas enzimas pudessem existir previamente em procariotas. Recentemente, com a descoberta de sequências putativas de proteases do tipo retropepsina e do tipo pepsina em procariotas, estas teorias têm sido abaladas. Efetivamente, a existência de uma protease ativa do tipo pepsina em procariotas foi recentemente documentada e provada experimentalmente. Por isto, é necessária a validação experimental no que toca à existencia destas proteases aspárticas do tipo retropepsina em procariotas. Estudos no nosso laboratório identificaram experimentalmente em Rickettsia uma protease aspártica altamente conservada provada como sendo ativa. Esta protease partilha assinaturas e motivos com as proteases do tipo retropepsina. No entanto, esta protease não será provavelmente a única: estudos bioinformáticos mostram a existência de um grande grupo de genes relacionados evolutivamente com a protease do tipo retropepsina encontrada em Rickettsia. Estas sequências foram encontradas em várias espécies distintas de procariotas, mas todas elas mostram características em comum com as proteases do tipo retropepsina, mantendo, no entanto diferenças significativas entre elas. O patogénio intracelular Legionella pneumophila é uma das espécies bacterianas que foram encontradas contendo estas sequências do tipo retropepsina no seu genoma. Neste estudo, o domínio solúvel putativo de uma sequência de uma protease XIV do tipo retroviral do genoma de Legionella pneumophila foi clonada e expressa em E. coli. O domínio solúvel desta proteína, chamado LegRPsd, foi caracterizado em termos de atividade enzimática a estados de oligomerização. Foi demonstrado que a proteína apresenta atividade proteolítica, e os resultados apontam para que estanova enzima pertença efectivamente à família das proteases aspárticas. A LegRPsd tem atividade proteolítica contra um substrato típico de proteases aspárticas a um pH ótimo de 4.0, atividade esta que é inibida em cerca de 50% na presença de pepstatina A. Foi também provado que a proteína sofre autoprocessamento, mudando o seu perfil de inibição no sentido de perda de inibição por pepstatina, acompanhada de um efeito inibitório por parte de inibidores da protease retroviral do HIV-1. A proteína também revelou outras similaridades com proteases retrovirais, como por exemplo a formação de um homodímero lábil, que se pensa ser necessário para a formação do centro ativo, e como tal, necessário para a atividade catalítica. Os resultados obtidos suportam a existência de uma protease de L. pneumophila evolutivamente relacionada com as retropepsinas não apenas em termos de homologia sequência-estrutura, mas também pelas suas características bioquímicas. Esta informação é extremamente importante por duas razões: primeiro, em conjunto com a protease aspártica de Rickettsia, constituem uma forte evidência de uma nova família de proteases aspárticas conservadas em procariotas relacionadas com as retropepsinas. Com isto é possível uma re-definição das teorias evolutivas no que toca a pepsinas e retropepsinas, com a apresentação de um novo ponto de vista onde estas sequências de procariotas representam uma forma mais ancestral das retropepsinas; em segundo lugar, a descoberta de uma protease aspártica em L. pneumophila tal como em outros organismos patogénicos levanta a possibilidade de encontrar novas vias de patogenecidade e consequentemente a descoberta de novos alvos terapêuticos para estas infeções resistentes, como alternativa ao tratamento por antibióticos convencionais.
Description: Dissertação de mestrado em Bioquímica apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
URI: http://hdl.handle.net/10316/24646
Rights: openAccess
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