Regulation of Mitochondrial Function in Ischemia/Reperfusion: Looking for Therapeutic Strategies in Fatty Livers

Abstract

Non-alcoholic fatty liver diseases (NAFLD) are associated with obesity and type II diabetes, which are rapidly increasing worldwide due to a fat rich diet and lack of exercise. Fatty liver is characterized by the accumulation of fat in the cytoplasm of hepatocytes derived from adipocytes, intestinal absorption or hepatic lipogenesis. Clinical data has shown that fatty livers are more susceptible to ischemia/ reperfusion (I/R) injury, leading to diminished liver function. Different hypothesis, such as impaired ATP synthesis, microcirculation, Kupffer cell dysfunction and increased leukocytical adhesion have been proposed for the increased susceptibility of fatty organs to ischemic injury. Fatty degeneration, which induces a series of alterations in mitochondria, renders these organelles intrinsically more susceptible to I/R injury. Impairment of oxidative phosphorylation and induction of the mitochondrial permeability transition (MPT) are critical determinants for mitochondrial dysfunction induced by prolonged periods of ischemia followed by reperfusion. Regarding this, and taking into account the increased incidence of this pathology, we aimed to protect fatty livers from I/R damage. Ischemic preconditioning (IPC) is a phenomenon in which brief periods of ischemia make tissues resistant to injury resulting from prolonged ischemia and reperfusion. Thus, it became crucial to define the functioning mechanisms of preconditioning (PC) to allow drug targeting in a pharmacological treatment in fatty livers, as a strategy to reduce I/R injury observed in transplantation and hepatic resections. The first strategy presented demonstrates that selective blocking of A1Rs with DPCPX abolished the protection achieved by ischemic preconditioning, and A1R agonist CCPA reproduced the beneficial effects. This fact confirms the participation of this receptor in protection induced by IPC in lean livers. This involves preservation of OXPHOS efficiency and increase resistance to MPT onset. Induction of the MPT by I/R leads to cell death by uncoupling oxidative phosphorylation, inducing mitochondrial swelling and collapsing mitochondrial membrane potential, thus blocking cellular ATP formation. IPC induces the increase of HSP70 that may further protect mitochondria and prevent the MPT, thus maintaining the ability to generate ATP and recover from I/R insult. We demonstrate that modulation of the MPT is 8 0 achieved in preconditioning (ischemic and pharmacological) in a GSK- 3β-dependent manner, which is essential to achieve protection in I/R. GSK-3β inhibition prevents impairment of hepatic mitochondrial function and depletion of cellular ATP. Pharmacological preconditioning with indirubin-3’-oxime, an inhibitor of GSK-3β, in conditions of hepatic I/R, protects the liver by maintaining mitochondrial calcium homeostasis, thus preserving mitochondrial function and hepatic energetic balance. I/R induces translocation of GSK-3β from the cytosol to the mitochondria, increasing mitochondrial GSK-3β activity. Indirubin-3’-oxime preserves the level of inhibition of GSK-3β activity on mitochondria, by preserving the mitochondrial pool of phospho- Ser9-GSK-3β, that is decreased in I/R. Although fatty livers exhibit an underlying state of mitochondrial dysfunction that enhances damage after I/R, treatment with indirubin- 3’-oxime was also able to preserve the efficiency of mitochondrial function and prevent I/R damage in fatty livers. We demonstrated that active GSK-3β (in I/R situation) promotes an enhancement of CypD phosphorylation, resulting in increased binding of CypD to the ANT, sensitizing mitochondria to calcium-induced MPT. Therefore, indirubin- 3’-oxime has great therapeutic potential in the clinical setting of hepatic ischemia/reperfusion, acting as pharmacological preconditioning in lean and fatty livers. The last protective strategy highlights the importance of MPT modulation against I/R injury in fatty livers, involving the preventive axis SIRT3-CypD-MPT. Obesity decreases the cellular NAD+/NADH ratio, thereby contributing to a decrease in SIRT3 activity, thus increasing the acetylation of mitochondrial proteins and decreasing mitochondrial efficiency. We demonstrated that the increase in CypD acetylation in I/R animals was accompanied by an inhibition of SIRT3 activity. Conversely, adding NAD+ to fatty livers prior to I/R significantly increases SIRT3 activity and decreases CypD acetylation, activity and binding to ANT, increasing the threshold to MPT induction. NAD+ modulates mitochondrial function and preserves oxidative phosphorylation, being protective against injury in a model of hepatic warm I/R in fatty livers.

As doenças do fígado gordo não-alcoólicas (NAFLD) estão associadas à obesidade diabetes tipo II, estão a aumentar rapidamente em todo o mundo devido a uma dieta rica em gorduras e falta de exercício. Um fígado gordo é caracterizado pela acumulação de gordura no citoplasma de hepatócitos, derivada de adipócitos, da absorção intestinal ou da lipogénese hepática. Os dados clínicos mostram que os fígados gordos são mais suscetíveis à lesão por isquemia/reperfusão (I/R), levando à diminuição da função hepática. Diferentes hipóteses, tais como síntese de ATP debilitada, microcirculação alterada, disfunção das células de Kupffer e aumento da adesão leucocitária têm sido propostas para o aumento da susceptibilidade de órgãos gordos à lesão isquémica. Este tipo de degeneração causada pela acumulação de gordura, induz uma série de alterações na mitocôndria, tornando estes organelos mais suscetíveis à lesão por I/R. Diminuição da eficiência fosforilativa e indução da transição de permeabilidade mitocondrial (MPT) são determinantes críticos para a disfunção mitocondrial induzida por períodos prolongados de isquémia seguidos de reperfusão. Tendo em conta o aumento da incidência desta patologia, o nosso objetivo é aumentar a resistência dos fígados gordos aos danos por I/R. Pré-condicionamento isquémico (IPC) é um fenómeno em que breves períodos de isquemia tornam os tecidos resistentes à lesão decorrente de isquemia e reperfusão prolongadas. Assim, tornou-se crucial definir os mecanismos subjacentes ao pré-condicionamento (PC) para permitir a identificação de alvos para drogas num tratamento farmacológico em fígados gordos como uma estratégia para reduzir a lesão por I/R observada no transplante e ressecções hepáticas. A primeira estratégia apresentada demonstra que o bloqueio seletivo de A1Rs com DPCPX aboliu a proteção obtida pelo précondicionamento isquémico, enquanto que um agonista de A1R, o CCPA, reproduziu os seus efeitos benéficos. Este fato confirma a participação deste receptor na proteção induzida pelo IPC em fígados magros. Isto envolve a preservação da eficiência fosforilativa e aumenta a resistência ao MPT. A indução da MPT por I/R leva a morte celular por desacoplamento da fosforilação oxidativa, induzindo entumescimento mitocondrial e o colapso do potencial de membrana mitocondrial, bloqueando assim a 10 0 formação de ATP. O IPC induz o aumento de HSP70 protegendo da indução do MPT, mantendo assim a capacidade para gerar ATP e recuperar do insulto por I/R. Demonstrámos que a modulação da MPT é alcançada em pré-condicionamento (isquémico e farmacológico) via modulação da GSK-3β. A inibição de GSK-3β previne a disfunção mitocondrial e depleção do ATP celular. Pré-condicionamento farmacológico com indirubina-3’- oxima, um inibidor de GSK-3β, em condições de I/R hepática, protege o fígado através da manutenção da homeostase do cálcio mitocondrial, preservando assim a função mitocondrial e o equilíbrio energético hepático. A I/R induz a translocação de GSK-3β do citosol para a mitocondria, aumentando a actividade da GSK-3β mitocondrial. A indirubina-3’-oxima preserva o nível de inibição da actividade da GSK-3β nas mitocondrias, preservando o “pool” mitocondrial de fosfo-Ser9-GSK-3β, que diminuí em I/R. Embora os fígados gordos exibam um estado subjacente de disfunção mitocondrial que aumenta os danos depois de I/R, o tratamento com indirubina-3’-oxima também foi capaz de preservar a eficiência da função mitocondrial e prevenir os danos da I/R em fígados gordos. Demonstrámos que a GSK-3β ativa (em situação de I/R) promove um aumento da fosforilação da CypD, resultando num aumento da ligação entre CypD e ANT, sensibilizando as mitocondrias à MPT induzida pelo cálcio. Portanto, a indirubina-3’-oxima tem um grande potencial terapêutico no estado clínico de isquemia/reperfusão hepática, atuando como précondicionamento farmacológico em fígados magros e gordos. A última estratégia de proteção destaca a importância da modulação da MPT contra a lesão da I/R em fígados gordos, envolvendo o eixo preventivo SIRT3-CypD-MPT. A obesidade diminui a o conteudo de NAD+ disponivel, contribuindo assim para uma diminuição na actividade da SIRT3,o que aumenta a acetilação de proteínas mitocondriais e diminui a eficiência mitocondrial. Demonstrámos que o aumento da acetilação da CypD em animais em situação de I/R foi acompanhada por uma inibição da actividade da SIRT3. Por outro lado, a adição de NAD+ a fígados gordos antes da I/R aumenta significativamente a actividade da SIRT3 e diminui a acetilação, actividade e ligação entre a ANT e CypD, aumentando a restência ao MPT. O NAD+ modula a função mitocondrial e preserva a fosforilação oxidativa, sendo protectivo contra danos num modelo de I/R hepática, em fígados gordos.