Please use this identifier to cite or link to this item: https://hdl.handle.net/10316/24602
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dc.contributor.advisorDuarte, Carlos-
dc.contributor.authorAzevedo, Ana Sofia Rodrigues dos Santos-
dc.date.accessioned2013-12-06T12:53:27Z-
dc.date.available2013-12-06T12:53:27Z-
dc.date.issued2012-
dc.identifier.urihttps://hdl.handle.net/10316/24602-
dc.descriptionTese de doutoramento em Biologia apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbrapor
dc.description.abstractWhilst all organisms developed schemes to respond to injury and illness, their capacity to recover from severe loss or damage of organs and appendages diverge quite a lot. A vertebrate organism that retained regenerative capacity is the zebrafish (Danio rerio). Its amenability to molecular and genetic manipulation turned it into a powerful regeneration model. In particular, zebrafish caudal fin regeneration has emerged as an ideal model to further study vertebrate regeneration due its accessibility and simple anatomical structure. The caudal fin is composed of several segmented bony rays. Each bony ray, with the exception of the most lateral, is bifurcated in the distal region of the fin. Regarding the caudal fin regeneration process, it is commonly believed that regeneration efficiency is lost upon repeated amputations. The aim of my thesis was to characterize in detail whether there is a decrease in regeneration efficiency and to identify the signalling pathways that are altered, in response to repeated injuries. To this end, we designed a protocol of consecutive repeated amputations in which the same caudal fins were subjected to three consecutive amputations every month. This protocol was repeated 10 times and resulted in a total of 29 amputations in the end of the protocol. Our results show that the size of the blastema, which is a structure comprised of progenitor cells that direct regeneration, and of the fully regenerated fin remains unchanged. Thus, consecutive repeated amputations of the zebrafish caudal fin do not reduce its regeneration capacity and do not compromise any of the successive regeneration steps: wound healing, blastema formation and regenerative outgrowth. The inhibition of Wnt/β-catenin signalling using heat-shock-mediated overexpression of Dickkopf1 (Dkk1) completely blocks fin regeneration. We overexpressed dkk1-gfp twice daily starting shortly before fin amputation and until 4 days-post-amputation (dpa) to completely inhibit fin regeneration. ii Once these fish were relieved from the heat-shock treatment, spontaneous regeneration did not occur. However, when fins were re-amputated at the non-inhibitory temperature, the caudal fin regenerated and reached its original length. To further challenge the regenerative capacity we performed repeated cycles of amputation, inhibition of Wnt/β-catenin signalling, recovery and second amputation. Remarkably, repeated blockage of blastema formation and fin regeneration after inhibition of Wnt/β-catenin signalling, did not diminish the regenerative capacity after a new amputation stimulus. We conclude that, blastema formation and regenerative outgrowth do not depend on a biological process that is permanently disrupted or depleted by loss of Wnt/β-catenin signalling. In spite of this amazing capacity to regenerate, we observed that, while the bone distal to the amputation plane (new bone) regenerated with a normal morphology, the bone proximal to the amputation plane (old bone) became progressively thickened with the repeated cycles of amputations. We suggest that this progressive bone thickening can be due to an inappropriate activation of osteoblasts that secrete matrix far away from the amputation plane or, alternatively, an unbalanced ratio of bone-forming and bone-degrading cells. Moreover, we detected an alteration in the original pattern of pigment cells and a distal shift in the position of the bony ray bifurcations in the regenerated caudal fins. We wanted to further investigate how the positional information is established during fin regeneration and whether it is altered by repeated amputations at different proximo-distal (PD) places along the fin. Our results show that upon a first amputation at 4 segments of the bony ray from the base of the fin (proximal amputation), the bifurcation position was immediately distalized when compared to its previous position in the uncut fin. Following the second, third and fourth amputation, the bifurcation position was maintained in the regenerated fin. On the other hand, the bifurcation position was progressively distalized when the amputations were done at 1 iii segment proximal to the bifurcation (near bifurcation – distal amputation). Thus, we show that while amputations performed at a long distance from the bifurcation do not change its PD position in the regenerated fin (after a first amputation), consecutive distal amputations induce a positional reset and progressively shift its position distally. Therefore, it is possible that an amputation proximally near the bifurcation will inhibit the signal responsible to initiate the formation of a bifurcation and consequently delay this process. We aimed to determine the signals involved in the control of the bifurcation position by the amputation place. To this end, we analyzed in detail the role of Sonic hedgehog (Shh), since previous reports propose that, preceding the formation of a bony ray bifurcation, shh duplicates its single domain. However, in contrast, our analysis shows that the dynamics of shh expression does not change in response to different amputation places, being always two domains of expression throughout the regeneration process. Thus, Shh does not seem to be the factor that modulates the bifurcation position during fin regeneration. Given the fact that it has been proposed that Shh might play a role in the osteoblasts patterning and/or differentiation during fin regeneration we analyzed Zns5 expression, an osteoblast marker in a shh-gfp transgenic reporter line. We observed that soon after the detection of shh expression, the bone alters its growing tip, and the forming osteoblasts start to be aligned close to the basal layer of the epidermis next to shh expressing cells. This leads to the hypothesis that shh expression in two separate domains might be important to align and direct the growth of the regenerating bone. Finally, we analyzed the implication of Fibroblast growth factor (Fgf) signalling in the modulation of the bifurcation position by the amputation place, since it was previously reported that the levels of Fgf signalling activation vary according to the PD place of amputation. This reveals the existence of positional memory in the regenerating fin that can be mediated or act through Fgf signalling. In order to investigate whether Fgf signalling would determine the PD position of the bifurcation in the regenerated fin, we iv made use of the hsp70:dn-fgfr1 zebrafish transgenic. This transgenic contains a dominant-negative fgfr1-egfp fusion gene (dn-fgfr1) driven by a heat-inducible zebrafish hsp70 promoter and efficiently attenuates Fgf signalling during fin regeneration in a dose dependent manner. However, Fgf signalling attenuation did not alter the position of the bony ray bifurcation, when compared to the controls, indicating that Fgf signalling may not be the trigger signal for the formation of a bifurcation in zebrafish fin regeneration. The establishment of positional memory during vertebrate regeneration has been mainly investigated in the amphibian limb. Nevertheless, the signals involved in the maintenance of positional memory remain poorly understood. The better understanding of this process in model organisms will be of great importance in the regenerative medicine field, namely to achieve the proper tridimensional structure for a successful and functional integration of the in vitro generated organs into patients. Additionally, we believe that better understanding of the cellular mechanisms underlying the virtually unlimited regenerative capacity of fish caudal fin regeneration will be informative for efforts to improve repair in humans.por
dc.description.sponsorshipApesar de todos os organismos terem desenvolvido mecanismos de resposta a um ferimento ou doença, a sua capacidade de recuperar de uma perda ou dano de órgãos ou apêndices é muito variada. Um organismo vertebrado que mantém a capacidade regenerativa é o peixe zebra (Danio rerio). A facilidade de manipulação molecular e genética, tornou este organismo num poderoso modelo de estudo da regeneração. Em particular, a barbatana caudal do peixe zebra devido à sua acessibilidade e a uma estrutura anatómica simples, tornou-se um modelo ideal para aprofundar o estudo de regeneração em vertebrados. A barbatana caudal é constituída por vários ossos segmentados. Cada osso, com a excepção dos ossos mais laterais, é bifurcado na parte distal da barbatana. Relativamente ao processo de regeneração da barbatana caudal é, na generalidade aceite, que haja uma perda de eficiência de regeneração após amputações repetidas. O objectivo da minha tese foi caracterizar em detalhe a hipótese de amputações repetidas provocarem uma diminuição da eficiência de regeneração e identificar as vias de sinalização envolvidas nessa resposta. Para isso, estabelecemos um protocolo de amputações repetidas, no qual as mesmas barbatanas caudais foram submetidas a três amputações consecutivas todos os meses. Este protocolo foi repetido 10 vezes, resultando num total de 29 amputações no final do protocolo. Os nossos resultados mostram que o tamanho do blastema, estrutura constituída por células progenitoras essenciais no processo de regeneração, e o tamanho final da barbatana caudal completamente regenerada, não são alterados. Desta forma, amputações consecutivas repetidas da barbatana caudal do peixe zebra não diminuem a sua capacidade de regeneração e não afectam qualquer um dos passos sucessivos de regeneração: cicatrização, formação do blastema e crescimento regenerativo. A inibição da via de sinalização Wnt/β-catenin através da sobre-expressão de Dickkopf1 (Dkk1) por método de choque térmico causa um bloqueio vi completo da regeneração da barbatana. Iniciámos a sobre-expressão de dkk1-gfp imediatamente antes da amputação da barbatana, duas vezes por dia até aos 4 dias-após-amputação (dpa), para inibir completamente a regeneração da barbatana. Uma vez não sendo mais expostos ao tratamento de choque térmico verificou-se que não ocorreu regeneração espontânea nestes peixes. Contudo, quando as suas barbatanas foram novamente amputadas a uma temperatura não inibitória, a barbatana caudal regenerou e atingiu o seu tamanho original. A fim de colocar ainda mais à prova a capacidade de regeneração realizámos ciclos repetidos de amputação, inibição da sinalização Wnt/β-catenin, recuperação e segunda amputação. Notavelmente, o bloqueio repetido da formação do blastema e da regeneração da barbatana após inibição da via de sinalização Wnt/β-catenin não diminuiu a capacidade regenerativa após o estímulo de uma nova amputação. Estes resultados permitem-nos concluir que a formação do blastema e o crescimento regenerativo não dependem de um processo biológico que é destruído permanentemente ou esgotado pela perda da via de sinalização Wnt/β-catenin. Apesar desta surpreendente capacidade de regenerar, observámos que, enquanto o osso distal em relação ao plano de amputação (osso novo) regenerou com a morfologia normal, o osso proximal em relação ao plano de amputação (osso velho) ficou progressivamente mais espesso com os ciclos repetidos de amputações. Sugerimos que este espessamento progressivo do osso possa ser devido a uma activação inapropriada de osteoblastos que secretaram matriz longe do plano de amputação ou, alternativamente, a um desequilíbrio no rácio de células que formam e degradam osso. Além disso, detectámos uma alteração no padrão original de células de pigmento e uma distalização na posição das bifurcações dos ossos das barbatanas caudais regeneradas. De seguida, investigámos como é estabelecida a informação posicional durante a regeneração da barbatana caudal e se é alterada por amputações repetidas a diferentes níveis proximo-distais (PD) ao longo da barbatana. Os vii nossos resultados revelam que após uma primeira amputação a 4 segmentos da base da cauda (amputação proximal) a bifurcação é imediatamente distalizada quando comparada com a sua posição prévia na barbatana não amputada. Após a segunda, terceira e quarta amputação, a posição da bifurcação foi mantida na barbatana regenerada. Por outro lado, a posição da bifurcação foi progressivamente distalizada quando as amputações foram efectuadas a 1 segmento proximal da bifurcação (perto da bifurcação – amputação distal). Deste modo, mostramos que, enquanto amputações efectuadas a uma grande distância da bifurcação não alteram a sua posição PD (após uma primeira amputação), amputações distais consecutivas induzem um “reset” posicional e alteram a sua posição para progressivamente mais distal. Assim, é possível que uma amputação perto da bifurcação iniba o sinal responsável por iniciar a formação da bifurcação e consequentemente atrase esse processo. Procurámos determinar os sinais envolvidos no controlo da posição da bifurcação pelo plano de amputação. Para este fim, analisámos em detalhe o papel de Sonic hedgehog (Shh) uma vez que, estudos anteriores propõem que, antes da formação de uma bifurcação de um osso, shh duplica o seu único domínio de expressão. Contudo, a nossa análise mostra que a dinâmica de expressão de shh não é alterada em resposta aos diferentes planos de amputação, estando sempre em dois domínios de expressão durante todo o processo de regeneração. Dado que foi proposto que Shh poderá ter um papel na padronização ou diferenciação de osteoblastos durante a regeneração da barbatana, procedemos à análise da expressão de Zns5, um marcador de osteoblastos, numa linha reporter transgénica shh-gfp. Observámos que logo depois da detecção da expressão de shh, o osso altera a forma da sua extremidade de crescimento e os pré-osteoblastos começam a alinhar-se perto da camada basal da epiderme junto às células que expressam shh. Isto conduz à hipótese de que a expressão de shh em dois domínios separados poderá ser importante para alinhar e direccionar o crescimento do osso a regenerar. viii Por fim, analisámos o envolvimento da via de sinalização Fibroblast growth factor (Fgf) na regulação da posição da bifurcação pelo plano de amputação, uma vez que já foi demonstrado que os níveis de activação da sinalização Fgf variam de acordo com o nível PD da amputação. Este dado revela a existência de memória posicional na barbatana durante a regeneração que pode ser mediada ou actuar através da via de sinalização Fgf. Com o intuito de investigar se a sinalização Fgf determina a posição PD da bifurcação na barbatana regenerada, utilizámos a linha transgénica de peixe zebra hsp70:dn-fgfr1. Este transgénico contém uma fusão genética fgfr1-gfp dominante-negativa (dn-fgfr1) sob influência do promotor induzido por choque térmico hsp70 de peixe zebra e atenua com uma eficácia dose-dependente a via de sinalização Fgf durante a regeneração da barbatana. Contudo, a atenuação da sinalização Fgf não afectou a posição da bifurcação do osso quando comparada com os controlos, indicando que a sinalização Fgf parece não ser o sinal activador para a formação da bifurcação na regeneração da barbatana caudal do peixe zebra. O estabelecimento de memória posicional durante a regeneração em vertebrados tem sido maioritariamente investigada no membro do anfíbio. Porém, os sinais envolvidos na manutenção da memória posicional continuam mal compreendidos. Uma melhor compreensão deste processo em organismos modelo terá uma grande importância na área da medicina regenerativa, nomeadamente para obter a estrutura tridimensional correcta dos orgãos criados in vitro,.de modo a assegurar com sucesso a integração funcional nos pacientes Adicionalmente, acreditamos que uma maior compreensão dos mecanismos celulares que suportam a capacidade regenerativa virtualmente ilimitada da barbatana caudal do peixe zebra será informativa para as tentativas de aumento da capacidade de reparação de tecidos em humanos.por
dc.language.isoengpor
dc.rightsopenAccesspor
dc.subjectPeixe-zebrapor
dc.subjectRNApor
dc.titleZebrafish caudal fin regeneration : the effect of repeated amputations and ageingpor
dc.title.alternativeRegeneração da barbatana caudal do peixe zebra : o efeito de amputações repetidas e envelhecimentopor
dc.typedoctoralThesispor
degois.publication.locationCoimbrapor
dc.peerreviewedYespor
uc.controloAutoridadeSim-
item.openairetypedoctoralThesis-
item.languageiso639-1en-
item.openairecristypehttp://purl.org/coar/resource_type/c_18cf-
item.cerifentitytypePublications-
item.grantfulltextopen-
item.fulltextCom Texto completo-
crisitem.advisor.researchunitCNC - Center for Neuroscience and Cell Biology-
crisitem.advisor.orcid0000-0002-1474-0208-
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