Infertilidade equina : múltiplas fragilidades ou um "fado" do espermatozóide

Abstract

As raças autóctones portuguesas de equinos estão representadas pelos Puro Sangue Lusitano (PSL), Garrano e Sorraia, sendo o PSL a que assume maior expressão. O Sorraia corresponde a um tipo equino com elevados níveis de consanguinidade que se encontra classificado como mantido de forma crítica. Para PSL e Sorraia, falta definir o padrão espermático e a capacidade dos seus espermatozóides (SPZ) suportarem as tecnologias de conservação ex situ. Além disto, os equinos são uma espécie de reprodução sazonal de dias longos não se sabendo, à nossa latitude, como varia a qualidade espermática ao longo do ano. Em produção animal, a predição do potencial de fertilidade do macho é importante contudo, em equinos, os exames tradicionais de avaliação da qualidade do esperma falham em detetar casos de subfertilidade e/ou infertilidade. Assim, constituíram objectivos deste trabalho avaliar: parâmetros do esperma, a sua capacidade para refrigeração e a fertilidade, em PSL e Sorraia; variações na qualidade devidas à sazão; e a aplicabilidade de outros exames como complemento ao espermograma sumário em garanhões. Para os PSL, utilizaram-se duas estratégias: colheita única/múltiplos garanhões (n=152) e múltiplas colheitas (n=371)/garanhão (n=9). Estas últimas foram comparadas com 113 ejaculados obtidos de 4 Sorraias. A sazonalidade foi avaliada sobre 589 ejaculados obtidos nos diferentes meses do ano, de 12 garanhões com diferentes índices reprodutivos, e analisados de acordo com 4 períodos: Setembro- Dezembro, Janeiro-Março, Março-Maio e Maio-Julho. Espermas obtidos de garanhões férteis e in(sub)férteis (n=53) permitiram estudar a presença, nos SPZ, de proteínas relacionadas com a hipótese SNARE de fusão de membranas, a ubiquitinação (n=29) à superfície dos SPZ, a funcionalidade das mitocôndrias (JC-1, n=210), a qualidade do ADN nuclear (TUNEL, n=165), a estabilidade (M540, n=77), a funcionalidade (HOS, n=94) e a integridade (eosina-nigrosina, n=309 e IP/SYBR 14, n=207) da membrana celular e do acrossoma (PSA-FITC, n=239) e a oxidação (C11BODIPY e TBARS, n=232) dos fosfolípidos de membrana. A oxidação lipídica foi também avaliada no plasma seminal (TBARSPS) e relacionada com os parâmetros referidos assim como com a actividade antioxidante total não-enzimática (TEAC) no PS e nos SPZ e com a integridade do ADN, avaliada, neste caso, pelo teste de dispersão da cromatina (SCDT), em PSL e Sorraia. No PSL, a mobilidade, morfologia e pH após colheita diferiram significativamente (P<0,05) entre “colheita única/múltiplos garanhões” e “múltiplas colheitas/garanhão” sem que se tenham observado efeitos da idade sobre os parâmetros avaliados. Contrariamente ao cavalo do Sorraia, que apresenta valores marginais e baixos índices reprodutivos, no PSL, os parâmetros do esperma são similares aos descritos para a generalidade das outras raças equinas. Para as duas raças autóctones foi notório o efeito do garanhão (P<0,05), enquanto fator individual de variação, sobre os parâmetros do esperma. Para a nossa latitude, observou-se a influência da sazão na modulação dos parâmetros seminais (P<0,05) observando-se, entre Março-Maio, superior qualidade espermática e entre Setembro-Dezembro, os valores de qualidade seminal mais baixos. A análise imunocitoquímica revelou a presença das proteínas sintaxina, VAMP, sinaptotagmina,Rab3a e NSF na região acrossómica dos SPZ assim como a presença de caveolina-1, proteína envolvida na organização de lipid rafts. Os garanhões in(sub)férteis apresentaram, nos seus ejaculados, uma percentagem de SPZ marcados para SNAREs e caveolina-1 significativamente inferior (P<0,001) ao observado nos animais de fertilidade comprovada. Um problema associado ao macho foi confirmado quando as éguas que tinham ficado vazias após inseminações com sémen de um macho com espermograma normal, foram beneficiadas com sucesso por um macho de fertilidade comprovada. A marcação da NSF, sintaxina e caveolina-1 parece útil na predição do potencial de fertilidade do garanhão. A utilização de vários marcadores da qualidade dos SPZ evidenciou também diferenças significativas nos ejaculados de animais férteis e in(sub)férteis, confirmando-se a melhor qualidade seminal durante a estação de reprodução, apesar da diversidade de populações espermáticas presentes em cada ejaculado. No conjunto das observações, os parâmetros PMS, vitalidade, morfologia, AI e integridade/estabilidade do ADN são modulados pelos parâmetros funcionais avaliados, excepto o teste HOST, contudo este revelou medir propriedades diferentes das dos métodos de exclusão de corantes. Os TBARS parecem situar-se dentro de níveis fisiológicos excepto no PS da raça Sorraia, uma vez que se observou um elevado nível de peroxidação lipídica coexistente com uma elevada atividade antioxidante não enzimática assim como com uma elevada percentagem de células com danos no ADN, conforme revelado pelo teste SCD. Os resultados sugerem alguma disfunção nos SPZ (ou na espermatogénese) desta raça, para além da observável ao nível morfológico e sugerem que a produção de ATP, nos SPZ, assente sobre a via glicolítica. A introdução dos testes HOS e SCDT na rotina laboratorial parece-nos útil na medida em que não necessitam de equipamento sofisticado e podem ser aplicados em condições de campo. Além disto, a marcação dos acrossomas e da superfície celular com marcadores moleculares pode constitur uma ferramenta útil na avaliação de casos de infertilidade idiopática em garanhões. Os resultados realçam, ainda, a importância do conhecimento do padrão espermático não só da raça mas do indíviduo em si mesmo de forma a maximizarem-se os índices reprodutivos. A interpretação de espermogramas efectuados na contra-estação deverá ser feita à luz dos valores próprios dos parâmetros espermáticos nesta altura do ano.

Portuguese horse breeds are represented by Puro Sangue Lusitano (PSL), Garrano and Sorraia. The PSL is the major national breed of horses and Sorraia horse is a closed and endangered breed. The seminal characteristics and the possibility of conserving their semen for future use are not well known. Furthermore, equines are long-day seasonal breeders and no data exist on seasonal variation in semen quality in horses for our latitude. In animal husbandry, prediction of fertility potential is important but, in stallions traditional semen evaluation fails to detect cases of sub-fertility or even infertility. The aim of this study was to evaluate: semen parameters, fertility and the aptness to sperm preservation in PSL and Sorraia stallions; seasonal variations in sperm quality; and the usefulness of other methods to assess sperm traits in order to complement the traditional spermiogram. For PSL, two strategies were used: a single collection by multiple stallions (n=152) and multiple collections (n=371) obtained from a limited number of stallions (n=9). These latter samples were compared with 113 ejaculates obtained from 4 Sorraia horses. The percentage of motile spermatozoa (PMS) was assessed after collection (AC), after semen dilution and after 24h of cool-storage. Seasonal variations in sperm quality were monitored in semen samples (n=589) collected from late September to July, from 12 stallions, and analyzed according to four seasonal periods: September-December, January-March, March-May, and May-July. Semen samples (n=53) obtained from stallions with varying fertility were also used to study the presence of proteins implicated in the "SNARE hypothesis" for membrane fusion as well as sperm ubiquitination (n=29), mitochondrial function (JC-1, n=210), nDNA (TUNEL, n=165) and acrosomal integrity (PSA-FITC, n=239) and plasmalema stability (M540, n=77), integrity (eosin-nigrosin, n=309 and IP/SYBR14 stain, n=207) and functionality (HOS test, n=94). Lipid peroxidation was also analyzed using the TBARS assay, in both seminal plasma and SPZ fractions (n=232), and related with the other seminal parameters as well as with total non-enzymatic antioxidant activity (TEAC, n=89) and nDNA integrity evaluated, in this case, by the SCD test (n=30), in PSL and Sorraia stallions. In PSL, mean values obtained for PMS, morphology and semen pH observed after semen collection differ significantly (P<0.05) between single collection/multiple stallions and multiple collections/limited stallions, and no age related effects were detected. Semen quality in PSL is similar to that of related breeds, while Sorraia stallions had very poor semen quality. Additionally, significant differences (P<0.05) were observed between individual stallions and between ejaculates within stallions. Clear seasonal-based differences (P<0.05) were observed, with poor semen quality in winter and a noticeable improvement in sperm quality with increasing photoperiod. Better semen quality was observed between late March and May. Immunocytochemical analysis revealed that members of different SNARE families can be detected on the acrosome of equine sperm, notably in the acrosomal cap and equatorial segment. These proteins include the R-SNARE syntaxin, the Q-SNARE synaptobrevin/VAMP, the calcium sensor synaptotagmin, the GTPase Rab3a and the ATPase NSF. Also present is caveolin-1, a component of lipid rafts. Stallions with fertility problems presented the worst quality of sperm and acrosomal membrane, and had less sperm cells stained positively for SNAREs and caveolin-1, than sperm from fertile donors (P<0.001). A male-related problem was confirmed when mares that had failed to impregnate with samples from a stallion with a normal spermiogram were successfully inseminated with sperm from a fertile donor. Furthermore NSF, syntaxin and caveolin-1 staining seemed to be useful in predicting stallion fertility. The other methods used to analyze sperm quality showed significant differences in semen quality between fertile and in(sub)fertile stallions and confirmed better semen quality during the breeding season despite an heterogeneous sperm population characterize each ejaculate, as revealed by the probes used. PMS, viability, morphology, AI and DNA integrity/stability are modulated by the functional parameters evaluated except HOST. However, HOST showed to measure different properties in sperm when compared with stain exclusion methods. In fertile stallions, TBARS in both sperm fractions never seemed to result in compromised sperm DNA integrity, indicating that measurements were within physiological levels. In Sorraia stallions, despite an apparent efficient antioxidant activity in sperm, TBARS in seminal plasma were higher and coexist with DNA damage, as revealed by SCDT. Our results suggest some dysfunction in spermatozoa (or spermatogenesis) of this breed, beyond the observable at morphological level and suggest that the production of ATP, in these cells, rely on glycolysis. The introduction of HOST and SCDT in routine sperm evaluation seems to be important since these methods do not need sophisticate equipment and can be used in field conditions. Moreover, acrosomal and surface staining of equine sperm with molecular markers may constitute useful tools in predicting stallion fertility. Our results also highlight the importance of knowledge of the standard sperm characteristics not only of the breed in use but also of individual stallion, for adjustment of the breeding program in order to maximize reproductive rates. Semen analysis made in the non-breeding season should be interpreted according with values defined to this year period.