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https://hdl.handle.net/10316/24502
DC Field | Value | Language |
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dc.contributor.advisor | Maciel, Patrícia | - |
dc.contributor.advisor | Duarte, Carlos | - |
dc.contributor.author | Baptista, Márcio | - |
dc.date.accessioned | 2013-10-31T12:38:40Z | - |
dc.date.available | 2014-08-27T02:00:09Z | - |
dc.date.issued | 2014-02-27 | - |
dc.date.submitted | 2013-09-30 | - |
dc.identifier.citation | BAPTISTA, Márcio Paulo Simões - Interplay between the ubiquitin-proteasome system and mechanisms of neurodegeneration in the context of Machado-Joseph disease. Coimbra : [s.n.], 2013. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/24502 | - |
dc.identifier.uri | https://hdl.handle.net/10316/24502 | - |
dc.description | Tese de doutoramento em Biologia, especialidade em Biologia Celular, apreentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra | - |
dc.description.abstract | O Sistema Ubiquitina-Proteosoma (SUP) é um dos maiores sistemas de degradação regulada de proteínas. O sistema é essencial para a manutenção da homeostase e sinalização celulares. O tipo de ligação entre ubiquitinas e o seu comprimento vão definir o destino dos substratos ubiquitinados. A ubiquitinação de substratos pode ser revertida pela acção das enzimas desubiquitinadoras (DUBs). As DUBs podem actuar através da edição ou desmontagem das cadeias de poli-ubiquitina, são responsáveis pela clivagem dos precursores de ubiquitina, por evitar a degradação de substratos-alvo, pela edição das cadeias de ubiquitina à entrada do proteossoma e também pela manutenção das reservas celulares de ubiquitina livre. O papel do SUP nas doenças do sistema nervoso tem sido caracterizado ao longo dos últimos anos, e em particular nas doença de expansão de poliglutaminas, tendo começado por evidências de que componentes do SUP faziam parte dos agregados de proteínas desnaturadas. A ataxina 3 (ATXN3) é uma DUB presente em todos ou quase todos os tecidos do corpo humano e do murganho. As funções da ATXN3 vão desde a edição das proteínas poli-ubiquitinadas, ao sequestro de proteínas agregadas em agregossomas, à regulação da degradação proteica e resposta ao stress, à determinação da adesão celular e da estrutura do citoesqueleto, à modulação da diferenciação celular, até à regulação da transcrição. A expansão de um tracto de poliglutaminas na ATXN3 resulta no desenvolvimento de uma doença neurodegenerativa, a Doença de Machado-Joseph (DMJ), também chamada Ataxia Espinocerebelosa Tipo 3, uma das ataxias mais comuns no mundo. Os objectivos deste trabalho foram a identificação de possíveis pontos de envolvimento do SUP em processos de neurodegenerescência, nomeadamente através da identificação da interacção entre a ATXN3 e uma chaperone molecular, a caracterização da influência de uma outra DUB (UCH-L1) na DMJ, e o papel do SUP na clivagem da Descarboxilase do Ácido Glutâmico (DAG) em situações de desregulação do cálcio celular/excitoxicidade. Neste estudo foi identificado um novo parceiro molecular da ATXN3, a chaperone molecular HSP60. A interacção é mediada pelo domínio catalítico activo, o domínio Josefina. A ATXN3 interactuou tanto com a forma monomérica como com a forma heptamérica da HSP60. Esta interacção pode levar à descoberta de novos mecanismos na interligação entre as chaperonas moleculares e o SPU, com o último a determinar o destino das proteínas depois do reconhecimento pelas primeiras da alteração na proteostase. A Hidrolase de Ubiquitina do terminal Carboxílico 1 (UBH-1) é o ortólogo da UCH-L1 dos vertebrados, uma enzima que para além da sua actividade de DUB também funciona como estabilizador de mono-ubiquitina, e como ligase de ubiquitna. Esta DUB tem sido descrita como estando envolvida na etiologia da Doença de Parkinson devido a alterações na sua actividade enzimática, e está descrita também como sendo um componente essencial da sinapse. A restauração dos níveis proteicos de UCH-L1 leva a um melhoramento na transmissão sináptica em modelos da Doença de Alzheimer. A sobre-expressão de genes pró-inflamatórios e a sobrecarga de espécies reactivas de oxigénio são uma marca reconhecida na maioria das doenças neurodegenerativas e também na DMJ. As Prostaglandinas (PGs) Ciclopentenonas são metabolitos da Prostaglandina D2 (PGD2), algumas das quais, como a 15-desoxi-Δ12,14-PGJ2 (15d-PGJ2), tem sido descrita como modulador da actividade da UCH-L1, também provocando a sua desnaturação e agregação. Neste trabalho avaliámos a contribuição específica da UBH-1 (a homóloga em C. elegans da UCH-L1) como possível modificador da DMJ num modelo de nemátode da doença. Verificámos que, sob tratamento com 15d-PGJ2, que foi capaz de induzir stresse oxidativo em estirpes repórter, não houve alterações em termos de motilidade ou agregação da ATXN3 nos animais. Estes resultados podem estar relacionados com a redundância funcional que a UCH-L1 partilha com a relacionada UCH-L3. A neurodegeneração característica na DMJ é caracterizada por alterações moleculares que interferem com a regulação da transcrição, agregação proteica, perturbam a função do SUP e desregulação da homeostasia do cálcio. Na DMJ a desregulação do cálcio é relevante, dado que a ATXN3 expandida se liga anormalmente ao receptor do tipo 1 de inositol 1,4,5-trifosfato (InsP3R1), um canal de cálcio envolvido em diversas funções celulares, e induz a libertação de cálcio pela sensitização do receptor ao seu ligando natural (InsP3). Em concordância, o tratamento com um inibidor de cálcio específico para o reticulo sarcoplasmático nos músculos esqueléticos melhora o comportamento de murganhos com DMJ. Tem sido demonstrado que a actividade do proteossoma é diminuída em situações de isquémia e a inibição do proteossoma tem provado ser protectora em isquémia cerebral, situações onde a desregulação do cálcio é critica. Mais recentemente, foi descrito que a estimulação excitotóxica leva ao desmembramento do proteosoma 26S nas suas subunidades, sendo a activação dos receptores N-metil-D-aspartato extra-sinápticos a responsável pela toxicidade. Assim, quisemos avaliar a contribuição do SUP para a desregulação do cálcio celular e especificamente para a clivagem da DAG, a enzima responsável pela síntese do ácido amino-butírico (GABA), o principal neurotransmissor inibitório na transmissão neuronal. Descobrimos que o estímulo excitotóxico com glutamato em culturas primárias de hipocampo de rato leva a uma clivagem dependente do tempo das duas enzimas (GAD65 e GAD67) levando a uma alteração na distribuição das GADs nas neurites. Esta clivagem foi inibida na presença de ininbidores do proteosoma e da enzima activadora de ubiquitina E1, indicando um papel para o SUP no processameento das GADs mediado pelas calpaínas. Em sumário, este trabalho contribuiu para a descoberta de novas interacções entre componentes do SUP e processos de neurodegenerescência. | por |
dc.description.abstract | The Ubiquitin-Proteasome System is a major intracellular pathway for regulated protein turnover. This system is essential for maintaining cellular homeostasis and signaling. Varying the ubiquitin linkage type and chain length influences the fate of ubiquitylated substrates. Substrate ubiquitylation can be reversed by the action of Deubiquitylating Enzymes (DUBs). DUBs act by editing or disassembling polyubiquitin chains, and are responsible for cleaving ubiquitin precursors, avoid target substrate degradation, editing of the ubiquitin chain at proteasome entrance and for the generation of free ubiquitin pools. The role of the UPS in nervous system disease has been characterized over the last years, and in particular concerning polyQ disorders has been extensively described, starting with evidence that components of the UPS were consistently found in misfolded protein aggregates. Ataxin-3 (ATXN3) is a DUB present in all or most tissues in humans and mice. Functions of ATXN3 range from the editing of polyubiquitylated proteins, sequestering aggregated proteins in aggresomes and modulating E3 ubiquitin ligases, to regulating protein degradation and stress response, determining cell adhesion and cytoskeletal structure, modulating cell differentiation and regulating transcription. Expansion of a polyglutamine tract in ATXN3 results in the development of the neurodegenerative disease Machado-Joseph disease (MJD), also called spinocerebellar ataxia type 3, the most common dominantly inherited ataxia worldwide. The aims of this work were the identification of the putative roles of the UPS in neurodegeneration, namely through the identification of a new binding partner for ATXN3, the characterization of the influence of another DUB (UCH-L1) in MJD, and the role of the UPS in Glutamic Acid Decarboxylase (GAD) cleavage upon calcium deregulation/excitotoxicity. In this study we identified a new molecular partner for ATXN3, the molecular chaperone HSP60. The interaction is direct and through the catalytically active domain of ATXN3, the Josephin domain. ATXN3 was able to interact with both the monomeric HSP60 as with the heptameric form of HSP60. This interaction might unravel new aspects of the interplay between molecular chaperones and the UPS and, with the second determining proteins’ fate after the recognition of altered proteostasis by the first. Ubiquitin C-terminal Hydrolase 1 (UBH-1) is the C. elegans orthologue of vertebrate ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 1, an enzyme that besides its deubiquitylating activity also works as a monoubiquitin stabilizer, and ubiquitin-ligase. This DUB has been described to be involved in the etiology of Parkinson Disease due to altered enzymatic activity, and is also described as an essential component of the synapse. Restoring UCH-L1 protein levels lead to improvements in synaptic transmission in Alzheimer’s disease models. The upregulation of proinflammatory genes and the overload of reactive oxygen species are a known hallmark in most neurodegenerative diseases and also in MJD. Cyclopentenone prostaglandins are metabolites of prostaglandin D2 (PGD2), some of which, such as 15-deoxy-Δ12,14-PGJ2 (15d-PGJ2), have been described as modulators of UCH-L1 activity, also leading to its unfolding and aggregation and also as inducers of the production of intracellular reactive oxygen species. In our work we evaluated the specific contribution of UBH-1 (Caenorhabditis elegans homologue of UCH-L1) as a possible modifier of MJD in a nematode model of the disease. We found that upon 15d-PGJ2 treatment, that was able to induce oxidative stress in our reporter strains, no alterations in terms of animal motility or ATXN3 aggregation were observed. These results might be related with the redundancy in functions that UCH-L1 shares with the close related UCH-L3. The characteristic neurodegeneration in MJD is characterized by molecular alterations that interfere with transcriptional regulation, protein aggregation and clearance, perturb UPS function and deregulate calcium homeostasis. In MJD calcium deregulation is relevant, as expanded ATXN3 binds aberrantly to type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptor (InsP3R1), a calcium channel involved in diverse cellular functions, and induces calcium release by sensitizing the receptor to its natural ligand (InsP3). Consistently, treatment with a specific inhibitor of calcium release from the sarcoplasmic reticulum in skeletal muscles improves the behavior of MJD mice. The activity of the proteasome has been shown to be downregulated in ischemia and inhibition of the proteasome has proven to be protective in focal brain ischemia, situations where calcium deregulation is critical. More recently, it was described that excitotoxic stimulation leads to the disassembly of the 26S proteasome in its subunits, and activation of extrasynaptic N-methyl-D-aspartate receptors (NMDA) is responsible for toxicity. We wanted to evaluate the contribution of the UPS to calcium deregulation and specifically to the described cleavage of Glutamic Acid Decarboxylase, the enzyme responsible for -Amino Butyric Acid (GABA) synthesis, the main inhibitory neurotransmitter in neuronal transmission. We found that excitotoxic stimulation with glutamate of cultured hippocampal neurons from rat lead to a time-dependent cleavage of the two enzyme forms (GAD65 and GAD67) leading to altered distribution in neurites. This cleavage was inhibited in the presence of proteasome and E1 activating enzyme inhibitors, thus indicating a role for the UPS in the calpain-mediated processing of GADs. In summary, this work has contributed for the discovery of new links between UPS components and neurodegenerative processes. | por |
dc.language.iso | eng | por |
dc.rights | embargoedAccess | - |
dc.subject | Sistema Ubiquitina-Proteosoma | por |
dc.subject | Neurodegenerecência | por |
dc.subject | Ubiquitin-Proteasome System | por |
dc.subject | Neurodegeneration | por |
dc.subject | Doença de Machado-Joseph | - |
dc.subject | Machado-Joseph disease | - |
dc.title | Interplay between the Ubiquitin-Proteasome System and mechanisms of neurodegeneration in the context of Machado-Joseph disease (Tese corrigida) | por |
dc.type | doctoralThesis | por |
dc.identifier.tid | 101277172 | - |
uc.controloAutoridade | Sim | - |
item.openairecristype | http://purl.org/coar/resource_type/c_18cf | - |
item.grantfulltext | open | - |
item.openairetype | doctoralThesis | - |
item.languageiso639-1 | en | - |
item.fulltext | Com Texto completo | - |
item.cerifentitytype | Publications | - |
crisitem.advisor.researchunit | CNC - Center for Neuroscience and Cell Biology | - |
crisitem.advisor.orcid | 0000-0002-1474-0208 | - |
Appears in Collections: | FCTUC Ciências da Vida - Teses de Doutoramento |
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