A Link Between Metabolic Signaling and Cognition: The Hippocampal Function of Ghrelin

Abstract

Peptide hormones such as insulin, leptin and ghrelin are well known for their role in the regulation of appetite. Recent evidence suggests that these peptides, in addition to acting on the hypothalamus to modulate food intake, may play wider roles in modulating brain functions. Ghrelin, a 28 amino acids peptide, is a regulator of growth hormone release, and an appetite-stimulating hormone, secreted from the empty stomach. Recent data show that ghrelin enters the hippocampus, enhancing hippocampal-dependent memory processes. Thus, ghrelin may represent the molecular link between learning capabilities associated to feeding behavior and energy metabolism, ensuring the ability to locate food sources, remember those locations, and recall whether all available food has been consumed, which are evolutionarily important skills for survival. However the molecular mechanisms that underlie the effects of ghrelin as a hippocampal cognitive enhancer are still not completely understood. Immunocytochemistry analysis showed that the ghrelin receptor presents a punctate distribution in hippocampal cultured neurons, with a significant population of ghrelin receptors localized to glutamatergic synapses. Moreover, the ghrelin receptor was found in synaptic fractions obtained from adult rat hippocampi. This synaptic localization of the ghrelin receptor suggests a possible involvement of ghrelin in modulating excitatory synaptic transmission. To start testing this hypothesis hippocampal cultured neurons were treated with a ghrelin receptor agonist (MK-0677) and quantitative immunofluorescence analysis was performed to analyze the synaptic cell surface expression of GluA1, a subunit of the AMPA-type glutamate receptors (AMPARs). Treatment with MK-0677 led to an increase in cell surface GluA1 levels colocalized with an excitatory synaptic marker. To directly determine whether ghrelin induces the delivery of new AMPARs into synapses, the GFP-tagged GluA1 subunit (GluA1-GFP) was expressed in CA1 neurons in organotypic hippocampal slice cultures. Slice treatment with ghrelin or with the ghrelin receptor agonist increased the synaptic delivery of homomeric GluA1-GFP AMPARs in activitydependent manner. These data strongly suggest that activation of the orexigenic ghrelin hormone receptor induces synaptic delivery of GluA1-containing AMPARs. To test whether ghrelin receptor activation produces a functional change at excitatory CA3-CA1 synapse, organotypic hippocampal slices were treated with the ghrelin receptor agonist and electrophysiological recordings were performed. Synaptic responses were evoked, and the ratios between AMPA/NMDA and NMDA/GABA currents recorded from CA1 neurons were calculated. The AMPA/NMDA ratio of synaptic responses significantly increased after MK-0677 treatment, while the NMDA/GABA ratio was found to be unaltered. Altogether, these results suggest that the ghrelin receptor activation increases AMPARs-mediated synaptic transmission in the hippocampus, by inducing delivery of GluA1-containing AMPARs receptors into synapses. Moreover, we found that MK-0677 treatment dramatically enhanced NMDARsdependent long-term potentiation (LTP) expression in the hippocampal CA3-CA1 synapse. Agonist application also increased the synaptic trafficking of endogenous GluA1-containing AMPARs in hippocampal cultured neurons upon chemical LTP induction (a model for LTP in hippocampal cultures). These findings suggest that ghrelin receptor activation increases the AMPARs delivery to synapses, facilitating the expression of LTP-like events. Given that changes in synaptic strength are considered the cellular substrate for memory storage in the brain, the effect of ghrelin receptor activation on hippocampal synaptic plasticity may underlie the cognition enhancing properties of ghrelin. The changes in AMPARs trafficking, and consequent functional alterations in hippocampal excitatory synaptic transmission and LTP expression, triggered by ghrelin receptor activation, were accompanied by increases in the phosphorylation of GluA1, as well as in the AMPARs-associated protein stargazin. Moreover, we observed an increase in the activation of the signalling pathways responsible for the phosphorylation of these molecular targets, which are known to be required for the induction of AMPARs synaptic trafficking, and for LTP expression. Finally, we obtained evidence for a developmentally regulated function of ghrelin receptor activation on AMPARs-mediated synaptic transmission. Whereas in young hippocampal slices the action of the ghrelin receptor is dependent on ligand-dependent activation, in more mature hippocampal slices the constitutive activity of the ghrelin receptor regulates AMPAR-mediated transmission. In conclusion, these findings point to a scenario in which the cognitive enhancing properties of ghrelin are likely mediated by its potential to increase the synaptic trafficking of GluA1-containing AMPARs, one of the most well characterized cellular processes required for the long lasting changes in synaptic strength underlying learning and memory formation.

Hormonas peptídicas como a insulina, leptina e grelina são sobretudo conhecidas pela sua função na regulação do apetite. No entanto evidências experimentais recentes têm sugerido que estes peptídeos, para além da sua função no hipotálamo como moduladores do apetite, podem também desempenhar amplos papéis na modulação das funções cerebrais. A grelina, um peptídeo de 28 aminoácidos, é um regulador da libertação da hormona de crescimento, e um estimulador do apetite secretado a partir do estômago vazio. Observações experimentais recentes demonstram que a grelina entra no hipocampo, melhorando processos de memória dependentes desta estrutura cerebral. Deste modo, a grelina pode representar a associação molecular entre capacidades de aprendizagem e o comportamento alimentar e metabolismo energético. Esta associação poderá ser importante no sentido de assegurar a capacidade de localizar fontes de alimento, de recordar tais locais e se todo o alimento disponível foi consumido. Estas capacidades constituem importantes aptidões evolutivas que permitem a sobrevivência. Contudo, os mecanismos moleculares que estão na base dos efeitos da grelina como agente potenciador das capacidades cognitivas relacionadas com o hipocampo não se encontram ainda completamente esclarecidos. Estudos de imunocitoquímica demonstraram que o receptor da grelina apresenta uma distribuição ponteada em neurónios do hipocampo em cultura, com uma fracção significativa do receptor a localizar-se em sinapses glutamatérgicas. Além disso, o receptor da grelina foi identificado em fracções sinápticas purificadas a partir de hipocampo de ratos adultos. Este padrão de localização sináptica do receptor da grelina sugere uma possível função da grelina na modulação da transmissão sináptica excitatória. Para testar esta hipótese começámos por tratar culturas de neurónios do hipocampo com um agonista do receptor da grelina (MK-0677), e realizámos uma análise de imunofluorescência quantitativa com o objectivo de avaliar a expressão superficial sináptica de GluA1, uma subunidade dos receptores de glutamato do tipo AMPA (AMPARs). Recorrendo a esta abordagem experimental observámos que o tratamento com MK-0677 levou a um aumento dos níveis de GluA1 à superfície dos neurónios e na sinapse. Com o objectivo de determinar directamente se a grelina induz a inserção de novos AMPARs na sinapse, a subunidade GluA1 ligada a GFP (GluA1-GFP) foi expressa em neurónios da região CA1 em fatias organotípicas do hipocampo. Observámos que o tratamento com grelina, ou com o agonista do receptor da grelina, aumentam a inserção sináptica de AMPARs homoméricos contendo GluA1-GFP. Estes resultados sugerem fortemente que a activação do receptor da grelina induz a inserção sináptica de AMPARs que contêm a subunidade GluA1. Com o objectivo de verificar se a activação do receptor da grelina produz uma alteração funcional na sinapse CA3-CA1 do hipocampo, fatias organotípicas foram incubadas com o agonista, e em seguida foram realizados registos electrofisiológicos. Após a indução de respostas sinápticas a partir de neurónios da região CA1, os rácios entre as correntes mediadas por receptores do tipo AMPA/NMDA e NMDA/GABA foram calculados. Observámos que o rácio entre as correntes AMPA/NMDA aumentou após o tratamento com MK-0677, enquanto o rácio entre as correntes NMDA/GABA não se alterou. No seu conjunto, estes resultados demonstram que a activação do receptor da grelina aumenta a transmissão sináptica mediada por receptores do tipo AMPA no hipocampo, através da inserção sináptica de AMPARs que contêm GluA1. Observámos também que o tratamento com MK-0677 aumenta dramaticamente a expressão da potenciação de longa duração (LTP) dependente de receptores de glutamato do tipo NMDA na sinapse CA3-CA1 do hipocampo. Além disso, verificámos que após indução de LTP químico (um modelo de LTP para neurónios do hipocampo em cultura), em neurónios previamente sujeitos ao agonista, existe um aumento do endereçamento sináptico de receptores endógenos do tipo AMPA contendo a subunidade GluA1. Este resultado experimental demonstra que a activação do receptor da grelina aumenta a inserção sináptica de AMPARs, o que leva à facilitação da expressão de eventos relacionados com LTP. Uma vez que alterações na força sináptica são consideradas como sendo o alvo celular para o armazenamento de memória no cérebro, o efeito da activação do receptor da grelina na plasticidade sináptica do hipocampo poderá justificar a acção da grelina como um agente potenciador da cognição. As alterações causadas pela activação do receptor da grelina, no tráfego de receptores do tipo AMPA e que alteram as características funcionais da transmissão sináptica excitatória e a expressão de LTP, foram acompanhadas por aumentos quer na fosforilação de GluA1, quer na fosforilação de uma proteína associada aos receptores do tipo AMPA, designada por stargazina. Além disso, observámos também a activação das vias de sinalização responsáveis pela fosforilação destes alvos moleculares, os quais se sabe serem necessários para a indução de inserção sináptica de AMPARs e expressão de LTP. Finalmente, obtivemos evidências que indicam que a função do receptor da grelina na regulação da transmissão sináptica mediada por receptores do tipo AMPA no hipocampo é regulada ao longo do desenvolvimento. Enquanto em fatias organotípicas do hipocampo mais jovens as acções mediadas pelo receptor são dependentes do ligando, em fatias mais velhas é a actividade constitutiva do receptor da grelina que regula a transmissão mediada por AMPARs. Em conclusão as observações experimentais aqui descritas sugerem que as propriedades da grelina como agente potenciador da cognição são mediadas pela sua capacidade de aumentar a inserção sináptica de receptores do tipo AMPA que contêm GluA1 no hipocampo. Este processo celular é um dos mais bem caracterizados como sendo necessário para as alterações de longa duração na força sináptica que estão na base da formação de memória e aprendizagem.