Estudo in vivo de caracterização da reacção inflamatória pós implantação de biomateriais à base de hidroxiapatite para aplicação em Medicina Dentária

Abstract

A inflamação, ou processo inflamatório, é uma reação do organismo a uma infeção/corpo estranho, ou lesão dos tecidos. Em caso de doentes com defeitos ósseos importantes resultantes de doença ou traumatismo, nos quais pretendemos prevenir problemas funcionais e estéticos, aliados à ausência de osso no complexo maxilo-facial, usam-se materiais de substituição óssea. Assim como acontece com a generalidade dos biomateriais, sabe-se que há uma panóplia de acontecimentos que ocorrem em consequência da implantação dos materiais de enxerto num organismo vivo. De entre estes acontecimentos, destaca-se a inflamação aguda e a inflamação crónica. O objetivo deste trabalho consistiu em estudar a reação inflamatória pós implantação muscular de dois materiais de substituição óssea: um xeno-enxerto de origem porcina (nome comercial Osteobiol Gen-Os®) e uma hidroxiapatite sintética (nome comercial Bonelike®), usados normalmente na clínica dentária. Efetuou-se uma avaliação histológica e de expressão genética, esta relativa ao número de transcritos de cinco genes alvo distintos, importantes no processo inflamatório (IL-1β, IL-6, TNF-α, CCL2 e CCL3). Previamente ao estudo in vivo da reação inflamatória, caracterizaram-se os materiais em termos de propriedades físico-químicas, uma vez que se sabe que essas propriedades influenciam de forma muito relevante a reação do sistema imunitário. Os biomateriais referidos foram caracterizados sob diversos pontos de vista: morfologia e distribuição do tamanho de partículas, área de superfície específica, de porosidade e tamanho de poros e densidade. A composição química e estrutura dos materiais foram estudadas por espetroscopia de infravermelhos (FTIR) e difração de raios X (XRD). Os materiais foram implantados nos músculos lombares de ratos Wistar e a resposta inflamatória foi avaliada através de análise histológica, uma semana (8 dias) após a implantação. Quanto à avaliação da expressão genética sistémica, procedeu-se à colheita de sangue no início da experiência e no momento da necropsia para todos os ratos, com o objetivo de avaliar alguns mediadores envolvidos na resposta inflamatória, neste caso específico os cinco genes alvo já referidos. A avaliação da expressão genética local foi realizada a partir do processamento de fragmentos musculares implantados com ambos os materiais separadamente. Os resultados mostraram que os dois enxertos são muito diferentes em praticamente todas as propriedades avaliadas. Enquanto o material xenógeno apresenta uma estrutura e uma composição similar à do osso natural, o material sintético é constituído por uma fase cristalina principal de hidroxiapatite e duas fases secundárias de fosfato tricálcio α- e β-. Os grânulos do material xenógeno, além de serem maiores, são irregulares e apresentam extremidades afiadas, enquanto os do material sintético são aproximadamente cilíndricos, com contornos arredondados e mais uniformes em tamanho. A resposta in vivo foi avaliada a partir dos infiltrados inflamatórios produzidos pelos materiais e revelou que, apesar de ambos os materiais não causarem inflamação grave, os grânulos do material sintético provocam uma reação inflamatória consistentemente mais intensa do que a desencadeada pelos grânulos do material xenógeno, particularmente no que diz respeito à produção de colagénio e formação de cápsula fibrosa. Relativamente à expressão genética, verificámos que os níveis de CCL2 e IL-1β se encontravam significativamente aumentados no sangue dos ratos implantados com o material sintético e com o material xenógeno, respetivamente. Os resultados para os níveis de transcritos de CCL3, IL-6 e TNF-α não mostraram diferenças estatisticamente significativas na análise sistémica. Na análise local, apresentam-se apenas resultados preliminares, mas os dados obtidos sugerem que o desempenho de ambos os materiais é semelhante, havendo maior produção de transcritos do que a nível sistémico, facto este que já era esperado. Os nossos resultados sugerem que os materiais de enxerto ósseo desencadeiam uma resposta sistémica por parte do hospedeiro, facto que é comprovado pelo aumento de mediadores inflamatórios no sangue periférico. O material sintético despoletou a formação de níveis significativamente mais elevados da expressão de CCL2, a quimiocina que ativa os macrófagos e que provoca uma polarização do sistema imunitário para Th2. O material xenógeno despoletou a formação de níveis mais elevados de expressão de IL-1β, citocina que é responsável pela ativação dos linfócitos. Desta forma parece haver uma resposta imunitária distinta para os dois biomateriais, em que cada um deles desencadeia a ativação de células com funções diferentes na resposta inflamatória. O material xenógeno, aos 8 dias, parece estar ainda numa fase inflamatória mais precoce do que acontece com o material sintético, durante o mesmo período temporal. Apesar de ter algumas limitações, este estudo é original e inovador e representa uma contribuição científica relevante na Medicina Dentária. Estudos como este podem trazer alguma luz para a compreensão da complexidade biológica e comportamento clínico dos substitutos ósseos.

Inflammation is a physiological reaction to an infection or tissue injury, that also occurs when biomaterials are implanted in a living host. In patients with significant bone loss resulting from trauma or disease, in which we want to recover function and aesthetics, biomaterials are often used as bone graft materials. As already mentioned, its implantation triggers a series of biological events. Among these events are included acute and chronic inflammations, whose effects are important to us in order to understand better the impact they have in the host, depending on the material’s origin. The aim of this work was to study the inflammatory reaction originated after intramuscular implantation of two bone graft materials: a xenograft of porcine origin (commercial name Osteobiol™ Gen-Os) and a hydroxyapatite based synthetic material (commercial name Bonelike™) commonly used in the daily clinic by histological evaluation and gene expression analysis based in the transcripts number of five distinct target genes, crucial to the inflammatory process (IL-1β, IL-6, TNF-α, CCL3 and CCL2). Prior to the in vivo study, both biomaterials were characterized in terms of physicochemical properties, as it is generally known that these properties influence the way the immune system reacts and therefore the inflammatory reaction. The xenogenous and the synthetic biomaterials were characterized in terms of morphology, particle size distribution, specific surface area, porosity and pore size and density. The chemical composition and structure of the materials were accessed by Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and X-ray Diffraction (XRD). The graft materials were then implanted in the lumbar muscles of Wistar rats and the inflammatory response was evaluated through histological analysis, after one week of implantation. For systemic gene expression analysis, blood was collected from the rat’s tail vein at the beginning of the experiment and at the moment of sacrifice of all rats, with the aim of quantifying some inflammatory mediators namely the five target genes already mentioned above. The local gene expression analysis was performed by processing lumbar muscle fragments implanted with both materials. The results showed that both grafts have quite different characteristics in almost all the evaluated properties. While the xenogenous material exhibits a structure and composition similar to the natural bone, the synthetic one is constituted by a main crystalline phase of hydroxyapatite and two secondary phases of α- and β-tricalcium phosphate. The xenogenous material granules, besides being larger, are irregular, and exhibit sharp-edged tips, while those of the synthetic material are approximately cylindrical, with round contours, and more uniform in size. The in vivo response evaluated from the inflammatory infiltrates revealed that although both implants did not cause severe inflammation, the synthetic granules elicit a consistently more intense inflammatory reaction than that triggered by the granules of the xenogenous material, particularly in terms of collagen production and formation of fibrous capsule. We concluded that CCL2 and IL-1β were significantly elevated in blood of mice implanted with the synthetic material and the xenogenous one, respectively. The transcript levels of CCL3, IL-6 and TNF-α did not show statistically significant differences in the systemic evaluation performed. In the local analysis we concluded that both biomaterials behave similarly, with production of higher levels of transcripts when compared to the systemic analysis through blood assessment, fact that was already expected. Our results suggest that bone graft materials trigger a systemic response from the host, fact that is proven by the increase of inflammatory mediators in the blood. The synthetic bone graft showed a Th2 polarization, triggering significantly higher levels of CCL2 expression, the chemokine that activates macrophages. The xenogenous bone graft triggered higher levels of IL-1β, the cytokine that is responsible for lymphocyte activation. Taken together, the in vivo data demonstrate that the inflammatory response appears to be different for the two biomaterials evaluated, with each one triggering the activation of different cell types. The xenogenous material, for an implantation time of 8 days, seems to be in an earlier phase of the inflammatory reaction when compared to the synthetic material, during the same time period. Despite some limitations, this study is unique and innovative and represents a significant scientific contribution in dentistry. Studies like this can bring some light to the understanding of complex biological and clinical behavior of bone graft materials.