Unraveling the mechanisms of spermicidal activity by surfactants: their potential use as multi-functional compounds

Abstract

A população humana está em constante crescimento. A ausência de contraceptivos controlados pela mulher é uma das principais causas que levam ao aumento exponencial da população, particularmente nas regiões subdesenvolvidas, uma vez que as mulheres não possuem poder social e económico suficiente para persuadir os seus parceiros. E o crescimento populacional vem geralmente acompanhado de pobreza, fome, cuidados de saúde precários e disseminação de doenças infecciosas como as doenças sexualmente transmissíveis (DSTs). Portanto, a necessidade urgente de encontrar novos espermicidas que sejam pouco dispendiosos, seguros, fáceis de usar e de armazenar, e que possam ser controlados pelas mulheres, tornam os surfactantes numa escolha atractiva para tentar evitar gravidezes indesejadas. Contudo, a eficácia e a segurança deste género de produto nem sempre são tão evidentes como seria de esperar. Formulações anteriores, que foram propostas como espermicidas eficazes (e.g. Nonoxynol-9), acabaram por se mostrar prejudiciais para o uso feminino. Por este motivo, tentando evitar o mesmo tipo de erros, é fundamental obter um conhecimento elementar mais preciso acerca da toxicologia associada aos surfactantes e à sua relação estrutura-actividade. Neste trabalho, testámos os efeitos tóxicos in vitro de diferentes famílias de surfactantes comercialmente disponíveis – não-iónicos (Triton X-100), zwiteriónicos (DDPS), aniónicos (SDS) e catiónicos (CnTAB, n= 10 a 16; C12PYR e C12BZK) – através de testes que avaliam parâmetros básicos relacionados com a sobrevivência dos espermatozóides, como sejam a viabilidade celular, mobilidade e integridade membranar. Outros aspectos mais específicos da função celular do espermatozóide também foram avaliados, como o potencial de membrana mitocondrial, capacitação, estado do acrossoma e sinalização por cálcio. Os resultados mostraram que a toxicidade dos surfactantes testados é dependente da dose e do tempo de exposição utilizados. Os dados sugerem também que a sua toxicidade é dependente da estrutura química. Efectivamente, o Triton X-100, DDPS e SDS são tóxicos para os espermatozóides a concentrações aproximadas à sua concentração micelar crítica (CMC), sugerindo assim um mecanismo de acção não-selectivo envolvendo disrupção membranar, uma forma de actuar típica dos surfactantes. Por outro lado, todos os surfactantes catiónicos (à excepção do C16TAB) mostraram ser tóxicos a concentrações bastante abaixo da CMC, sugerindo que estes surfactantes não estão aqui a actuar como detergentes típicos, induzindo um efeito de morte celular somente via disrupção membranar, mas tendo como alvo vias mais específicas que subsequentemente levam à morte dos espermatozóides. Os compostos catiónicos anfifílicos da família CnTAB, diferindo apenas no número de carbonos na sua cadeia hidrofóbica, apresentaram uma dependência linear da sua toxicidade em relação ao comprimento da cadeia alquil; tendo sido igualmente demonstrado que a toxicidade dos surfactantes é dependente da estrutura química do grupo polar, uma vez que surfactantes com grupos polares maiores (C12PYR e C12BZK) e carga positiva mais deslocalizada (C12PYR) mostraram ser os mais tóxicos para os espermatozóides. A acção distinta dos surfactantes catiónicos é também observada relativamente aos efeitos na fisiologia da membrana celular: foi demonstrado que estes deterioram predominantemente a integridade fisiológica, mais que a estrutural, da membrana dos espermatozóides, o que sugere que estes compostos podem, antes mesmo de induzir morte celular, afectar eventos fisiologicamente importantes que ocorrem na membrana celular dos espermatozóides. Uma vez que os surfactantes catiónicos foram os mais eficientes e promissores, actuando abaixo da CMC, outros aspectos da função celular nos espermatozóides foram analisados, de maneira a desvendar outros alvos para a toxicidade dos surfactantes. Foi então observado que os compostos testados (C12TAB, C12PYR e C12BZK) danificam o potencial de membrana mitocondrial, indicando que podem interferir com o metabolismo energético nos espermatozóides. Foi ainda encontrada uma inibição do fenómeno de capacitação (um passo vital para o espermatozóide se tornar competente e fertilizar o ovócito) aquando da incubação com C12PYR e C12BZK, bem como uma diminuição da percentagem de acrossomas intactos nos espermatozóides na presença de C12PYR e C12TAB (o espermatozóide deve apresentar o acrossoma intacto, por forma a sofrer reacção acrossómica no momento adequado – próximo do ovócito – e assim ser capaz de penetrar e fundir-se com o gâmeta feminino). As experiências envolvendo movimentos de cálcio no espermatozóide revelaram ainda que todos os compostos provocam um aumento do cálcio intracelular, sendo C12PYR e C12TAB os mais eficientes, explicando assim potencialmente os efeitos, mais tardios, na capacitação e estado do acrossoma. Estes dados relativos à sinalização por cálcio, além de constituírem uma novidade na avaliação de espermicidas, parecem ser particularmente sensíveis quando comparados com outros testes utilizados na avaliação de alterações funcionais nos espermatozóides. Finalmente, os resultados apresentados neste trabalho contribuem para uma melhor compreensão dos possíveis mecanismos mediados por surfactantes nos espermatozóides, o que pode revelar-se útil no desenvolvimento de surfactantes mais eficientes como espermicidas de aplicação tópica. Os dados evidenciam ainda a importância de metodologias in vitro mais eficazes para uma melhor avaliação de potenciais espermicidas, uma vez que esta metodologia oferece pistas fundamentais relativamente à aplicabilidade e segurança na utilização de uma variedade de compostos eventualmente espermicidas.

The human population is steadily increasing. The lack of women-controlled contraceptives is one of the major causes that lead to the exponential increase in population growth, especially in undeveloped regions, since women do not have the social and economic power to persuade their partners. And accompanying this increase is poverty, hunger, lack of health care and the dissemination of infectious diseases such as sexually transmitted infections (STDs). So, the urgent need for new cheap, safe, easy-to-use and easy-to-store women-controlled spermicides makes surfactants an attractive choice for avoiding unwanted pregnancies. However, the efficacy and safety of this kind of product is not always as obvious as would be expected. Past formulations that have been proposed as efficient spermicides (e.g., Nonoxynol-9) turned out to be unsafe for female use. For this reason, and in order to avoid the same mistakes, a more fundamental knowledge concerning surfactant toxicology and structure-activity correlation is required. In this work, we tested the in vitro toxic effects of different families of commercially available surfactants – non-ionic (Triton X-100), zwitterionic (DDPS), anionic (SDS) and cationic (CnTAB, n=10 to 16; C12PYR and C12BZK) – through tests that evaluate basic parameters for sperm cell survival, such as viability, motility and membrane integrity. Other finer aspects of sperm cell function were also assessed, such as mitochondrial membrane potential, sperm capacitation, sperm acrosome status and calcium signaling. The results showed that the toxicity of the surfactants tested was dose- and time-dependent. Data also suggested that their toxicity is dependent on the chemical structure. Indeed, Triton X-100, DDPS and SDS were toxic to sperm at concentrations around their critical micelle concentration (CMC), suggesting a non-selective mechanism of action involving cell membrane disruption, a typical mode of action for surfactants. On the other hand, all the cationic surfactants (with the exception of C16TAB) were toxic at concentrations far below their CMC, suggesting that these surfactants are not acting here as typical detergents, killing solely via membrane disruption, but targeting more specific pathways, subsequently leading to sperm cell death. Cationic amphiphiles of the CnTAB family, differing only in the carbon number of their hydrophobic chain, revealed a linear dependence of their toxicity on the alkyl chain length; it was also demonstrated that surfactant toxicity is dependent on the chemical structure of the polar head group, given that surfactants with larger polar head groups (C12PYR and C12BZK) and more delocalized positive charge (C12PYR) were the most toxic to sperm. The distinct action of cationic surfactants is also observed regarding the effects on the physiological aspect of the cell membrane: they were shown to impair predominantly the physiological, rather than the structural, sperm membrane integrity, which suggests that before killing the sperm cell they may be affecting important physiological events occurring in the sperm plasma membrane. As cationic surfactants were the most efficient and interesting compounds since they were acting below the CMC, other aspects of sperm cell function were evaluated in order to find different targets for surfactants toxicity. It was then observed that all the compounds tested (C12TAB, C12PYR and C12BZK) impaired mitochondrial membrane potential, indicating that they may interfere with sperm energy metabolism. An inhibition of sperm capacitation (a required step for sperm to become competent and fertilize the oocyte) was found after incubation with C12PYR and C12BZK. A reduction in the percentage of intact acrosomes (sperm must have an intact acrosome in order to suffer acrosome reaction in the proper time – near the oocyte – and thus, be able to enter inside the female gamete and fuse) was achieved in the presence of C12PYR and C12TAB. Experiments with sperm calcium movements revealed that all the compounds were able to increase sperm intracellular calcium, with C12PYR and C12TAB the most efficient, possibly explaining downstream effects on capacitation and acrosomal status. This data on calcium signaling, besides being the first time that spermicides are evaluated on this parameter, seemed to be particularly sensitive compared with other assays in detecting sperm function changes. Finally, the data presented in this work contributes to the understanding of the possible mechanisms mediating surfactant effects on sperm cells, which may be helpful for the design of more efficient surfactants as topical spermicides. The results also highlight the importance of using more efficient in vitro methodologies in order to better evaluate possible spermicidal candidates, since they seem to offer vital clues on the applicability and safety of a variety of compounds.