Treatment strategies for melanoma: pharmacological and toxicological action mechanisms of combined therapies

Abstract

A terapêutica disponível para o melanoma apresenta elevada toxicidade e uma baixa eficácia. O desenvolvimento e a progressão do melanoma envolvem diferentes mecanismos e a combinação de fármacos permitirá obter tratamentos mais efetivos e com efeitos adversos menos acentuados. O antiestrogénio tamoxifeno (TAM) é amplamente prescrito para pacientes com carcinoma da mama, mas induz vários efeitos adversos e a sua eficácia é limitada pelo metabolismo interindividual ou pela coadministração de medicamentos que possam diminuir os níveis dos seus metabolitos ativos, o endoxifeno (EDX) e o 4-hidroxitamoxifeno (OHTAM). O TAM tem sido também usado no tratamento do melanoma, todavia a sua utilização e os mecanismos de acção nesta patologia permanecem controversos. Assim, dado que alguns dos efeitos adversos do TAM resultam de indução de disfunção mitocondrial, investigámos os efeitos do EDX em mitocôndrias de fígado, individualmente ou em combinação com o ácido trans-retinóico (RA) para clarificar se o EDX é uma alternativa menos tóxica; posteriormente, estudámos também os efeitos do EDX numa linha celular de melanoma, individualmente ou em combinação com o RA ou com o antagonista dos recetores do N-metil-D-aspartato (NMDA) MK-801, para avaliar a eficácia do EDX no melanoma relativamente ao TAM. Estudámos também a expressão e a função do recetor associado à proteína G 30 (GPR30) nas células de melanoma para clarificar o mecanismo de ação dos antiestrogénios. Os resultados obtidos demonstram que o EDX apenas afecta a função bioenergética mitocondrial em concentrações superiores às atingidas nos tecidos, induzindo uma ligeira alteração na integridade da membrana mitocondrial, contrariamente aos efeitos acentuados do TAM. O EDX também inibiu a permeabilidade transitória mitocondrial (MPT) induzida por cálcio e fosfato. O RA é um eficiente citostático cuja utilização clínica é limitada pelos seus efeitos adversos, incluindo hepatotoxicidade, que está possivelmente associada à indução da MPT. Uma vez que as combinações de RA com o TAM apresentam ação sinérgica em células do cancro da mama e que os nossos resultados demonstram que o EDX é menos tóxico para a mitocôndria, avaliámos os efeitos do RA em combinação com o EDX na bioenergética mitocondrial e na MPT. O EDX, assim como o TAM e o OHTAM, preveniu a MPT induzida pelo RA, podendo contribuir para reduzir a sua hepatotoxicidade. Os efeitos do RA na bioenergética mitocondrial não foram potenciados pelo EDX. Deste modo, a combinação de EDX com o RA poderá apresentar vantagens na terapêutica do melanoma. Assim, e considerando que o RA e o TAM individualmente diminuem a proliferação e a migração das células de melanoma, estudámos os efeitos do EDX combinado com o RA nestas células. A combinação de RA com EDX potenciou significativamente a ação antiproliferativa de ambos os compostos, induzindo bloqueio do ciclo celular em G1, indicando que os seus mecanismos de ação convergem na regulação do ciclo celular. Contudo, verificámos que o TAM não potenciou os efeitos antiproliferativos do RA. A combinação do RA com EDX diminuiu ainda a migração das células de melanoma em concentrações que não afetaram a proliferação de células não-neoplásicas. Recentemente, foi demonstrado que o MK-801 diminui a proliferação de células do melanoma. Após testarmos os efeitos dos antagonistas dos recetores ionotrópicos do glutamato em células do melanoma, selecionámos o MK-801 para estudar em combinação com o TAM, OHTAM e EDX. Os antiestrogénios atuaram sinergicamente com o MK-801 na diminuição da proliferação das células do melanoma, sendo as combinações com EDX e OHTAM as mais eficazes, bloqueando a progressão do ciclo celular em G1. O papel emergente do GPR30 no cancro levou-nos a investigar a sua expressão e função no melanoma, uma vez que este recetor é ativado pelo TAM e pelo OHTAM. Verificámos que a linha celular de melanoma expressa o GPR30 e que o seu agonista seletivo G-1 reduziu drasticamente a proliferação celular, sugerindo que o GPR30 poderá ser um novo alvo terapêutico no melanoma e, possivelmente, estar envolvido na ação antiproliferativa dos antiestrogénios nestas células. Estudámos ainda os efeitos dos antiestrogénios na via das cinases reguladas por sinal extracelular (ERK) e verificámos que nas condições experimentais utilizadas o EDX é mais potente do que o TAM na redução da fosforilação da ERK 1/2, podendo justificar a maior eficácia do EDX em relação ao TAM no melanoma, individualmente ou em combinação com o RA ou com o MK-801, que também modulam esta via de sinalização. Assim, os resultados obtidos indicam que o EDX poderá ser uma alternativa ao TAM no tratamento do cancro e mais eficaz no melanoma maligno, particularmente em associação com outros fármacos.

The available treatments for melanoma rely on aggressive strategies that fail to alter the history of the disease. The onset and progression of melanoma involves a complex molecular machinery and, therefore, the use of combinations of drugs is a rational approach to build more effective treatments and to minimize side effects. The antiestrogen tamoxifen (TAM) is widely prescribed for patients with breast carcinoma, but induces several adverse effects. Moreover, the efficacy of TAM is limited by the individual metabolism or by coadministered medication that may decrease the effective levels of TAM active metabolites, endoxifen (EDX) and 4-hydroxytamoxifen (OHTAM), which are responsible for the anticancer action of TAM. TAM is also used in the treatment of melanoma, but its inclusion in therapeutic regimens and its action mechanisms remain controversial. In the present work we had the following goals: as some of TAM adverse effects result from mitochondrial damage, we investigated the effects of EDX on liver mitochondrial function, either individually or in combination with all-trans-retinoic acid (RA), to clarify whether EDX is a less toxic drug; afterwards, we studied the effects of EDX on a melanoma cell line individually or in combination with RA or with the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antagonist MK-801, to assess the efficacy of EDX in melanoma in comparison with TAM. Finally, we evaluated the expression and role of the G protein-coupled estrogen receptor 30 (GPR30) in melanoma cells to characterize the action mechanisms of antiestrogens. Our results show that EDX compromised mitochondrial bioenergetics at concentrations higher than those reached in tissues and mildly affects mitochondrial membrane integrity in comparison with TAM, suggesting that the adverse effects related with mitochondrial damage can be minimized by using EDX instead of TAM. Furthermore, like TAM or OHTAM, EDX prevented the mitochondrial permeability transition (MPT) induced by Ca2+ and phosphate. RA is a powerful anticancer agent, but its clinical utilization is limited by its adverse effects, including the hepatotoxicity, which is probably related with MPT induction. Since the combinations of RA with TAM demonstrated a synergism of action in breast cancer cells and our results show that EDX is less toxic to mitochondria, we monitored the effects of RA in combination with EDX on mitochondria. EDX, similarly to TAM or OHTAM, prevented RA-induced MPT. Moreover, RA compromised mitochondrial bioenergetics in a concentration-dependent manner, but its effects were not enhanced by EDX. Thus, the combination with EDX may contribute to reduce the hepatotoxicity of RA and low concentrations of both drugs might be given together with acceptable toxicity. Considering these promising results and that RA and TAM decrease the proliferation and migration of melanoma cells individually, we investigated the effects of EDX in combination with RA on melanoma cells. RA combined with EDX significantly enhanced the antiproliferative activity of the drugs alone by inducing cell cycle arrest in G1, indicating that their mechanisms of action converge in the regulation of the cell cycle. In contrast, TAM was unable to potentiate the actions of RA. The combination of RA with EDX also decreased melanoma cell migration at concentrations that do not affect the proliferation of non-neoplasic cells, suggesting that the combined treatment of RA and EDX may be devoid of significant toxicity. Recently, it was reported that MK-801 decreases melanoma cell proliferation. Thus, after investigating the effects of ionotropic glutamate receptor antagonists on melanoma cells, we chose MK-801 to combine with TAM, OHTAM and EDX. The antiestrogens acted synergistically with MK-801 to decrease melanoma cell proliferation and the combinations with EDX and OHTAM were more effective than the combinations with TAM, inducing cell cycle arrest in G1. The emerging role of GPR30 in cancer, which is activated by TAM and OHTAM, led us to investigate its expression and function in melanoma. The melanoma cell line used expressed GPR30 and its activation by the selective agonist G-1 markedly decreased cell proliferation, pointing out that the GPR30 is a new target in melanoma and it is possibly involved in the antiproliferative effect of antiestrogens on melanoma cells. We also addressed the effects of antiestrogens on the activation of the extracellular signal-regulated kinase (ERK) pathway and we found that, in our experimental setting, EDX was more effective than TAM in the reduction of ERK 1/2 phosphorylation, providing the first clues on the superior efficacy of EDX over TAM in melanoma, either individually or in combination with RA or MK-801, which also target this pathway. Altogether, the data obtained support that EDX may be an alternative to TAM in cancer therapy and a more effective drug for the management of malignant melanoma, particularly in therapeutic association.