Modulation of GABAA Receptors in Cerebral Ischemia: alterations in receptor trafficking coupled to neuronal death after oxygen/glucose deprivation

Abstract

A isquémia cerebral resulta de um fornecimento insuficiente de sangue ao cérebro, levando a uma desregulação no equilíbrio entre a neurotransmissão excitatória/inibitória e consequente morte celular por excitotoxicidade. A actividade das redes neuronais no sistema nervoso central (SNC) é determinada maioritariamente pelo balanço entre a neurotransmissão glutamatérgica e GABAérgica, que se encontra aumentada e reduzida, respectivamente, nas lesões isquémicas. O papel desempenhado pelo glutamato nos danos isquémicos está largamente documentado, ao contrário das alterações na neurotransmissão inibitória que permanecem pouco estudadas. Estudos in vivo e in vitro mostraram uma desregulação da neurotransmissão GABAérgica em cérebro isquémicos, ao nível pré- e pós-sináptico. A incubação de fatias de hipocampo na ausência de oxigénio e glucose (OGD) induz uma libertação rápida de GABA por exocitose, seguida de uma fase tardia em que ocorre a libertação do neurotransmissor mediada por reversão do transportador da membrana plasmática. A diminuição dos transportadores vesiculares do GABA na sinapse e a perda de ATP são dois mecanimos que podem estar na origem da redução da libertação excitotóxica de GABA. Os receptores de GABA do tipo GABAA (GABAAR) são os principais intervenientes na inibição sináptica rápida no SNC e a diminuição da sua expressão superficial foi demonstrada em modelos de isquémia in vivo e in vitro. A estabilização da expressão superficial dos GABAAR foi recentemente correlacionada com a protecção de neurónios do hipocampo e do córtex cerebral sujeitos a OGD, e o bloqueio da internalização dos GABAAR dependente da interacção AP2/clatrina reduz também a morte neuronal causada pela OGD. Estas evidências indicam que o número de GABAAR na superfície celular e a internalização deste receptor desempenham um papel modulador da morte celular causada pela isquémia. Porém, os mecanismos moleculares envolvidos na internalização dos GABAAR não foram ainda desvendados. Neste trabalho investigámos os mecanismos moleculares envolvidos na diminuição dos GABAAR em culturas de hipocampo submetidas OGD, um modelo in vitro de isquémia cerebral. A exposição transitória de neurónios de hipocampo a OGD fez diminuir os níveis totais das subunidades dos receptores GABAA características de receptores sinápticos (α1, α2, β3, γ2), por um mecanismo dependente da activação de calpaínas, mas não afectou os níveis da subunidade δ, tipicamente encontrada em receptores extra-sinápticos. Resultados semelhantes foram observados na região de enfarte em murganhos sujeitos à oclusão da artéria cerebral média (MCAO). Experiências de PCR quantitativo mostraram uma diminuição da expressão das subunidades dos GABAAR do tipo α1, α2, β2, β3 e γ2 mediada pela activação dos receptores do glutamato. Contudo, a inibição da transcrição não contribuiu para a diminuição dos níveis de proteína total das subunidades dos GABAAR. A maioria dos GABAAR presentes no cérebro contêm as subunidades 2α, 2β, e 1γ2, e apresentam uma grande mobilidade entre a localização sináptica e extra-sináptica. A acumulação do receptor nas sinapses inibitórias é regulada pela gefirina, uma proteína estrutural que permite a estabilização dos GABAAR na sinapse. A população de GABAAR da superfície neuronal é reciclada continuamente entre a membrana plasmática e os compartimentos intracelulares. Os mecanismos de regulação da expressão superficial dos GABAAR desempenham um papel fundamental no controlo dos níveis de receptor na sinapse e, consequentemente, da actividade sináptica inibitória. A internalização dos GABAAR é regulada negativamente pela fosforilação das subunidades β3 ou γ2 numa sequência intracelular. Em condições fisiológicas normais a fosforilação destas subunidades é controlada pela calcineurina, uma fosfatase activada pela entrada de Ca2+ através dos receptores NMDA. Contudo, não foram ainda identificadas as alterações no controlo do tráfego dos receptores GABAA durante a isquémia cerebral. Neste estudo, combinámos abordagens bioquímicas e de imagiologia celular para investigar os mecanismos que regulam a internalização dos GABAAR após um estímulo de OGD transitório. Verificámos que a OGD diminui a interação GABAAR/Gefirina e induz a internalização dos GABAAR pela via endocítica dependente de clatrina. A redução da interação GABAAR/Gefirina e o aumento da internalização dos GABAAR é regulada por fosforilação, como demonstrámos pelos ensaios de co-imunoprecipitação de proteínas com os receptores de superfície e pelo ensaio de “antibody-feeding”, respectivamente. Seguidamente, mostrámos que a OGD induz a desfosforilação e a internalização das subunidades β3 dos receptores GABAA, expressos em grande quantidade no hipocampo e no córtex cerebral, duas regiões particularmente vulneráveis à excitotoxicidade. Os dados obtidos usando fosfo-mutantes da subunidade β3 dos GABAAR permitiram-nos concluir que a desfosforilação do receptor causada pela OGD e a sua consequente internalização contribuem para a morte neuronal. Após a internalização, os GABAAR são rapidamente reciclados e voltam para a membrana plasmática ou são encaminhados para os lisossomas a fim de serem degradados. O rumo que os GABAAR endocitados tomam depende da interacção das subunidades β1-3 com a proteína associada à huntingtina 1 (HAP1). Verificámos que a OGD reduz também a reciclagem dos GABAAR de volta para a membrana plasmática e diminui a sua interacção com a proteína HAP1. Em resumo, neste trabalho propomos um novo modelo no qual a dissociação do complexo GABAAR/Gefirina e a desfosforilação do receptor são passos fulcrais na diminuição da actividade GABAérgica durante a isquémia cerebral, com consequente morte neuronal.

Cerebral ischemia is a pathological condition caused by insufficient blood supply to the brain, which causes an imbalance between excitatory/inhibitory neurotransmission and excitotoxic neuronal death. The activity of neuronal networks in the CNS is mainly determined by the balance between glutamatergic and GABAergic neurotransmission, which is up- and down-regulated, respectively, during ischemic insults. In contrast with the role of glutamate in ischemic damage, which is largely documented, the alterations in inhibitory neurotransmission remain poorly understood. In vivo and in vitro studies have shown a downreregulation of GABAergic neurotransmission in the ischemic brain, both at the pre- and post-synaptic levels. Exposure of hippocampal slices to oxygen and glucose-deprivation induces an early release of GABA by exocytosis, followed by a delayed phase of neurotransmitter release mediated by reversal of the plasma membrane transporter. The downregulation of vesicular GABA transporters and the loss of ATP is likely to cause a delayed inhibition of exocytotic release of GABA. GABAA receptors (GABAAR) are the major players in fast synaptic inhibition in the CNS, and a downregulation of the surface expression of GABAARs has been shown in in vivo and in vitro models of ischemia. Furthermore, it was recently shown that stabilization of GABAAR surface expression correlates with neuroprotection in hippocampal and cerebrocortical neurons subjected to Oxygen Glucose Deprivation (OGD), and blockade of AP2/clathrin dependent internalization of GABAAR also reduces OGD induced cell death. Together, these evidence indicates that the number of GABAAR at the cell surface and receptor internalization play a key modulatory role in the induction of ischemic cell death, but the molecular mechanisms involved in receptor internalization have not been elucidated. In the present work we investigated the molecular mechanisms underlying GABAAR downregulation in cultured hippocampal neurons subjected to OGD, an in vitro model of ischemia. Transient exposure of hippocampal neurons to OGD downregulated the total protein levels of GABAAR subunits characteristic of synaptic receptors (α1, α2, β3, γ2), but was without effect on the δ subunit that is typically found in extrasynaptic recepors. Similar results were observed in the infarct core of mice subjected to middle cerebral artery occlusion (MCAO). The downregulation of GABAAR subunits in cultured hippocampal neurons subjected to OGD was mediated by calpains. Quantitative PCR experiment showed a decrease in the expression levels of α1, α2, β2, β3 and γ2 GABAAR subunits that was mediated by activation of glutamate receptor, but inhibition of transcription activity did not account for the downregulation of GABAAR subunit protein levels. The majority of GABAAR in the brain are assembled from at least 2 α-, 2 β-, and 1 γ2-subunits. GABAAR present also a dynamic mobility between synaptic and extrasynaptic localization, being the accumulation of the receptor at the inhibitory synapses regulated by its scaffold protein gephyrin. Furthermore, the neuronal surface GABAAR are in a continue cycle between the plasma membrane and intracellular compartments, and the regulation of the total receptor surface expression plays a key role in the control of the postsynaptic pool size and the strength of synaptic inhibition. The GABAAR internalization rate is negatively regulated by phosphorylation of β3 or γ2 GABAAR subunits on their intracellular loop. Thus, NMDAR signaling is known to control the stability of synaptic GABAAR via calcineurin and GABAAR dephosphorylation. However, so far the alterations in the regulation of GABAAR trafficking that occur during pathological conditions, such as brain ischemia, remain completely unexplored. In this work we combined biochemical approaches and cell imaging to investigate the mechanisms regulating the internalization of GABAAR following transient OGD. We found that OGD decreases GABAAR/Gephyrin interaction and induces the internalization of GABAAR via clathrin dependent endocytosis. Both reduction of GABAAR/Gephyrin interaction and the increase in GABAAR internalization were found to be regulated by phosphorylation as assessed by surface co-immunoprecipitation assay and antibody-feeding, respectively. Moreover, we demonstrated that OGD-induced dephosphorylation and internalization of β3 GABAAR subunits, which are present in a large proportion of receptor subtypes in the hippocampus and cortex, regions that are particularly vulnerable to excitotoxicity. Furthermore, our data showed that the OGD-induced receptor dephosphorylation and consequent internalization contributes to neuronal cell death, as demonstrated using a phospho-mutant of the β3 GABAAR subunit. Following internalization, GABAARs are rapidly recycled back to the neuronal plasma membrane or targeted for lysosomal degradation. The decision regarding the sorting of endocytosed GABAARs depends on the interaction of GABAAR β1-3 subunits with huntingtin-associated protein 1 (HAP1). We found that OGD also reduced the recycling of GABAAR back to the plasma membrane and decrease their interaction with the HAP1 protein. Overall, we propose a new model in which GABAAR/Gephyrin dissociation and receptor dephosphorylation are key steps for GABAergic down modulation during cerebral ischemia and consequent neuronal cell death.