Paramagnetic NMR of Proteins to study the Collagenolytic Mechanism of MMP-1

Abstract

As Metaloproteinases da Matrix (MMPs) são uma família de proteínas com vários domínios que orquestram a homeostase dos tecidos através de uma complexa rede proteolítica. Desta forma, a desregulação da actividade das MMPs é responsável por doenças severas, principalmente relacionadas com a degradação dos tecidos. Dentro das MMPs, a subfamília das colagenases possui a peculiar actividade de degradar tanto o colagénio de hélice tripla como o colagénio fibrilar, que são imunes a virtualmente todas as restantes proteases. Durante o desenvolvimento tumoral, a sobreexpressão de MMPs collagenolíticas leva à degradação dos componentes da matriz extracelular com consequente libertação de células tumorais e possível formação de metastases. Por estas razões, as MMPs têm sido alvo de estudos farmacológicos desde há mais de quatro décadas. A Metaloproteinase-1 da Matriz foi a primeira MMP a ser sequenciada e é uma das colagenases mais importantes. A forma activa da MMP-1 é constituída por dois domínios: o domínio catalítico, responsável pela acção proteolítica, e o domínio hemopexínico, que tem um papel crucial no mecanismo de collagenólise. Ambos têm aproximadamente 20 kDa e estão interligados por um segmento peptídico não estruturado de catorze amino ácidos.

É actualmente aceite que a flexibilidade intrínseca entre os dois domínios da MMP-1 (e das MMPs em geral) é responsável em grande medida pela acção colagenolítica da enzima. No entanto esta flexibilidade não foi ainda descrita cuidadosamente. Também, apesar das variadas pistas que se têm obtido sobre o mecanismo de degradação do colagénio, os movimentos da maquinaria molecular que a promovem não são ainda entendidos na sua totalidade. Neste trabalho, tivemos como objectivo descrever detalhadamente a reorientação recíproca dos domínios da MMP-1 e posteriormente revelar o complexo formado entre a enzima e um substrato de hécie tripla que mimetiza o colagénio natural.

Para alcançar o nosso objectivo, funcionalizámos o domínio catalítico da MMP-1, inactivo (E219A), na proteína truncada e na proteína completa, nas posições H132C e K136C, com a nova sonda paramagnética [(Ln)CLaNP-5]. Diversos equipamentos de RMN de campo alto foram usados para obter dados paramagnéticos de alta resolução (desvios de pseudocontacto e acoplamentos dipolares residuais) relativos aos derivados (Ln)MMP-1. Foram usados vários Lantanídeos de modo a adquirirmos um vasto conjunto de dados paramagnéticos complementares. As ferramentas bioinformáticas disponíveis no laboratório e no Portal Web WeNMR foram usadas para obter os correspondentes tensores paramagnéticos. Durante este processo, desenvolvemos um método, dentro do programa CYANA, capaz de refinar modelos de raios-X usando dados de RMN paramagnético no estado líquido. O método foi bem sucedido, e obtivemos os modelos refinados dos dois domínios da MMP-1. O método provou também ser muito fidedigno em identificar modelos de cristalografica que não são coerentes com a estrutura real no estado líquido, como é o caso da proteína móvel a Calmodulina.

Os modelos refinados serviram como “input” nos cálculos de “Maximum Occurrence”, juntamente com outros dados independentes e previamente publicados. Deste modo, obtivemos um mapa tridimensional completo e descritivo do espaço conformacional explorado pela MMP-1, com detalhe quer na posição quer na orientação relativa dos domínios. Esta informação, obtida por RMN paramagnético, é pioneira neste campo e não é considerada pelos modelos de cristalografia. O mapa conformacional mostrou que as conformaçoes presentes durante mais tempo em solução são também aquelas que estão direccionadas para o ataque colagenolítico.

Posteriormente, isolámos, também em solução, o complexo entre a (Ln)MMP-1 inactiva e um peptídeo de hélice tripla (em inglês, THP), no instante anterior à clivagem proteolítica de uma das cadeias singulares. Os dados de RMN paramagnético sobre o complexo permitiram-nos determinar a orientação dos domínios da enzima quando da ligação ao THP e consequente desenrolar da tripla hélice. Neste estado, a MMP-1 revela-se rígida e com uma orientação ligeiramente diferente dos modelos de raios-X. Finalmente, conjugámos todos os dados adquiridos neste projecto com outros previamente publicados de modo a gerar um modelo inteiramente derivado de informação experimental. O modelo obtido concorda com todos os dados introduzidos e ainda com outra informação independente, nomeadamente, estudos mutacionais nos locais ligação exógenos do domínio hemopexínico.

Os resultados aqui apresentados revelam dois passos desconhecidos no processo colagenolítico: o prólogo e o estado final do complexo envolvido. Estes dados podem ser também extrapolados para outras MMPs de modo a desvendar os mecanismos moleculares desta peculiar família de enzimas e servir como base para a pesquisa de novas abordagens farmacológicas.

Matrix Metalloproteinases (MMPs) are a family of multi-domain proteases which orchestrate tissue homeostasis in a highly complex proteolytic networkby degrading structurally unrelated substrates. In this way, severe diseases, mainly related to tissue degradation, occur when MMPs are incorrectly regulated. Within MMPs, the subfamily of collagenases has the very peculiar activity of degrading triple helical and fibrillar collagen, which are immune to virtually all other proteases. During tumor development, the overexpression of collagenolytic MMPs leads to the degradation of the extracellular matrix components with the consequent release of tumorous cells and possible occurrence of tumor metastasis. For these reasons, MMPs have been the target of pharmacological research for at least three decades. The Matrix Metalloproteinase-1 enzyme was the first MMP to be sequenced and is one of the most important collagenolytic MMPs. The active form of MMP-1 is constituted by two domains: a catalytic domain, responsible for the proteolytic action of the enzyme, and a hemopexin-like domain, which serves as crucial partner in the collagenolytic mechanism. Both have approximately 20 kDa and are linked by an unstructured hinge region of 14 amino acids.

Is currently accepted that the intrinsic flexibility between the MMP-1 domains (and of MMPs in general) is responsible to a large extent for the collagenolytic action of the enzyme, although such flexibility has not yet been described in detail. In addition, despite the many clues that have been drawn on the collagenolytic mechanism, the movements of the molecular machinery that promote it are not yet clearly understood. In this work, we aimed at describing the reciprocal reorientation of the MMP-1 domains and to unveil the complex that is formed between MMP-1 and a triple helical substrate that mimics the natural collagen.

To achieve our purpose, we functionalized the inactive (E219A) catalytic domain of MMP-1 (in both truncated and full length constructs) at positions H132C and K136C, with a newly developed paramagnetic Lanthanide(III) tag (CLaNP-5)To achieve our purpose, we functionalized the inactive (E219A) catalytic domain of MMP-1 at positions H132C and K136C, in both truncated and full length constructs, with the newly developed paramagnetic Lanthanide(III) tag, CLaNP-5. High field NMR equipment served to acquire high resolution paramagnetic data (pseudo contact shifts and residual dipolar couplings) on the (Ln)MMP-1 constructs. Several Ln(III) ions were probed in order to acquire a large body of complementary data. The bioinformatic tools available in the CERM laboratory and at the WeNMR Web Portal were used to derive the corresponding Δχ-tensors. In the process, we develop a method, within the CYANA program, aimed at refining existing X-ray models using liquid state paramagnetic NMR restraints. The method proved to be successful and two solution refined models were obtained for the catalytic and the hemopexin domains. The method proved also highly reliable in identifying X-ray models which do not reflect the solution state of the protein, as is the case of the mobile Calmodulin.

The refined models of the MMP-1 domains served as input, along with the large body of paramagnetic NMR data and SAXS data, in the Maximum Occurrence analysis, which was used to obtain a fully descriptive 3D map of the conformational space sampled by MMP-1, with detail on both position and orientation. This information, obtained by paramagnetic NMR, is pioneer in the field and is not considered by the X-ray crystallographic models. The conformational map showed that the conformations that are more prone to occur in solution are effective to the collagenolytic action, and, instead, those that do not favor such action are much less relevant in the conformational space explored by MMP-1.

After that, we were able to isolate, also in solution, the complex between the inactive (Ln)MMP-1 enzyme and a triple helix peptide (THP) at the instant prior to the proteolytic cleavage of the individual substrate chain. We acquired paramagnetic NMR data on the complex which allowed us to determine the relative orientation of the domains when actively ligating and unwinding the collagen-like substrate. MMP-1 revealed to be rigid in behavior and its conformation to slightly differ from the X-ray models. Finally, we merged all the data acquired during this project with several previously published and independent data on this interaction to generate a completely data driven model of the latest step of the MMP-1-THP interaction. The model obtained nicely respects all the inputted data and many other published data regarding, for example, the crucial collagenolytic exosites on the hemopexin domain.

The results presented in this thesis illuminate two crucial gaps that existed in the understanding of the collagenolytic mechanism performed by MMP-1, which are its prologue and final step. Also, they can be extrapolated to other MMPs to help unveil the molecular mechanism of this peculiar family of enzymes and serve as basis for developing future pharmacological approaches.