The importance, origin and tolerance mechanisms of T. Regulatory Cells during pregnancy

Abstract

Pregnancy represents a challenge for the maternal immune system. It has to be alert against pathogens while tolerating paternal alloantigens expressed in fetal structures. T regulatory cells (Treg) are important mediators of tolerance and they have been described as participants in the tolerance mechanisms towards paternal antigens that allow fetal maintenance. However, it is still not clear whether their role is indispensable for the onset, the maintenance of pregnancy or both. Additionally, their origin and mechanisms of action throughout the different phases of pregnancy are issues that still need further clarification. The main objective of this thesis was to address whether Treg have a decisive role in pregnancy. We first analyzed the population of Treg during the estrus cycle and observed that Treg accumulate in the vaginal fluid and uterus even prior to conception during the receptive phase of the oestrus cycle. Treg depletion after dyphteria toxin (DT) application in a Foxp3DTR model seriously impaired implantation, while their depletion after conception only marginally affected pregnancy by slightly increasing the abortion rate. These results show that Treg are only essential at the beginning of pregnancy. However, several authors observed an increased in their number thereafter. Thus, we tested the kinetics of Treg during pregnancy and whether Treg at different gestation points are thymic-derived or are converted in the periphery. We reported a general augmentation in the total population of Treg starting before implantation, on day 2 of pregnancy and described that at this time point, in thymus, uterus and uterine draining lymph nodes, Treg exhibit an augmented expression of Helios, a marker that was described to define thymic derived Treg. At later stages, the predominant population is Helios-, suggesting their peripheral conversion. In fact, we showed that Foxp3+ Treg are generated in the periphery in a Rag1-/- model of cell transfer. We confirmed a de novo conversion of CD4+Foxp3GFP- into CD4+Foxp3GFP+ cells, that was independent of TGF- and took place at implantation and mid gestation (days 5 and 10 respectively). To understand the players involved in Treg location during pregnancy we selected several chemokines whose receptors are present at Treg surface and therefore can mediate their migration to the reproductive area. We observed that CCL21 and CCL25 are present in decidua and placenta during pregnancy and are able to attract Treg in vitro. We next observed that Treg are almost absent in the uterus of CCR7-/- mice, showing that this receptor determines their homing to the uterus. CCR9-/- mice have normal Treg frequencies but an increased population of T effector cells in the uterus as well as a higher maturation state of dendritic cells from the uterine draining lymph nodes. Similar to what we observed previously by the DT depletion of Treg, the lack of either chemokine receptor critically interfered with implantation. This clearly shows that lack of Treg or an excess of Teff hinders implantation. Our data provides new insights in the generation, origin and function of Treg during pregnancy, essential to understand natural mechanisms of tolerance acquisition.

A gravidez representa um desafio para o sistema imune materno. É necessário que este esteja alerta contra possíveis organismos patogénicos e, ao mesmo tempo, se mantenha tolerante perante os antigénios paternais expressos nas estruturas fetais. As células T reguladoras (Treg) são importantes mediadoras da tolerância e têm sido descritas como participantes nos mecanismos de tolerância para com os antigénios paternais, possibilitando a persistência do feto no útero materno. No entanto, não está ainda esclarecido se o papel destas células é indispensável para o início da gravidez, para a sua manutenção ou ambos. Adicionalmente, a sua origem e os mecanismos de ação das Treg durante as várias fases da gravidez são assuntos que necessitam uma melhor clarificação. O principal objectivo desta tese foi compreender se as Treg têm um papel decisivo na gravidez. Analisámos inicialmente a população de Treg durante o ciclo do estrus e observámos que estas células se acumulam no fluido vaginal e útero ainda antes da concepção, durante a fase receptiva do ciclo do estrus. A depleção das Treg através da aplicação da toxina da difteria em um modelo Foxp3DTR afetou fortemente a implantação, enquanto que a sua depleção após a concepção apenas afetou marginalmente a gravidez com um aumento mínimo na taxa de aborto. Estes resultados indicam que as Treg são apenas essenciais no início da gravidez. No entanto, vários autores observaram que o seu número aumenta mais tarde. Sendo assim, testámos a cinética destas células durante a gravidez e se elas são geradas no timo ou convertidas na periferia em diferentes estágios de gestação. Observámos um aumento geral na população total de Treg que começou antes da implantação, no dia 2 de gravidez e descrevemos que, neste período, no timo, útero e nódulos linfáticos que drenam o útero, as Treg exibiam um aumento de expressão de Helios, um marcador que foi descrito como definindo as Treg com origem no timo. Mais tarde, a população predominante é Helios-, o que sugere a conversão das Treg na periferia. Adicionalmente, através de um modelo de transferência de células em ratinhos Rag1-/-, pudemos demonstrar que as Treg são convertidas na periferia. Observámos também que esta conversão de novo de células CD4+Foxp3GFP- para CD4+Foxp3GFP+ ocorre de um modo independente de TGF- durante a implantação e a meia gestação. De forma a entender quais os processos envolvidos na localização das Treg durante a gravidez, selecionámos várias quemoquinas cujos receptores estão presentes na superfície das Treg e que podem assim mediar a sua migração para a área reprodutiva. Observámos que o CCL21 e o CCL25 se expressam na decídua e placenta durante a gravidez e são capazes de atrair as Treg in vitro. De seguida, observámos que as Treg estão quase ausentes no útero de ratinhos CCR7-/- demonstrando que este receptor determina a sua localização no útero. Os ratinhos CCR9-/- têm frequências normais de Treg mas exibem um aumento de células T efetoras no útero, assim como apresentam uma maior maturação das células dendríticas dos nódulos linfáticos que drenam o útero. Em semelhança com o que observámos antes, através da depleção das Treg pela aplicação de DT, a ausência de qualquer destes receptores de quemoquina interferiu criticamente com a implantação. Isto demonstra que a falta de Treg ou um excesso de células T efetoras impede a implantação. Os nossos resultados constituem novos dados sobre a origem e função das Treg durante a gravidez, essencial para compreender os mecanismos naturais de aquisição de tolerância.