Idiosyncrasy of drug induced mitochondrial liabilities : from mitochondrial DNA single nucleotide polymorphisms to mitochondrial sirtuins

Abstract

Mitochondria are not only cell furnaces but are also the main targets for many toxic compounds. Mitochondrial DNA (mtDNA) variations, including single nucleotide polymorphisms (SNPs) have been proposed to be involved in idiosyncratic drug reactions (IDRs). Although a rare phenomenon, IDRs are a serious and sometimes fatal complication. Therefore, IDRs are a major challenge for pharmaceutical companies which see their costly drugs being withdrawn from the market. However, current in vitro and in vivo models lack the genetic diversity observed in the human population and are not suitable to evaluate mitochondrial idiosyncratic drug-induced toxicity. The objective of this thesis was to identify novel intrinsic aspects of host-dependent mitochondrial physiology that may contribute to IDRs. These two intrinsic properties are mitochondrial DNA (mtDNA) SNPs and the content/expression of mitochondrial sirtuins. The first specific aim was to identify whether different cell strains with distinct mtDNA SNPs have different mitochondrial bioenergetic profiles and resistance to drug-induced toxicity. An in vitro system composed of four strains of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) with mtDNA polymorphisms was used for this specific aim. We sequenced mtDNA from embryonic fibroblasts isolated from four mouse strains, C57BL/6J, MOLF/EiJ, CZECHII/EiJ and PERA/EiJ, with the latter two being sequenced for the first time. The bioenergetic profile of the four strains of MEFs was investigated at both passages 3 and 10, in order to investigate cell culture aging as well. Our results showed clear differences among the four strains of MEFs at both passages, with CZECHII/EiJ having a lower mitochondrial fitness when compared to C57BL/6J, followed by MOLF/EiJ and PERA/EiJ. The second objective in this specific aim was to test seven drugs known to impair mitochondrial function in our in vitro model for their effect on cellular ATP content in both glucose- and glucose-free, galactose-containing media. Our results demonstrated strain-dependent differences in the response to some of the tested drugs. We propose that this model is a useful starting point to study compounds that may cause mitochondrial off-target toxicity in early stages of drug development, thus decreasing the number of experimental animals used. For the second specific aim, we investigated the role of mitochondrial sirtuins on drug-induced toxicity. Mammalian sirtuins are a family of seven protein deacetylases involved in many different cellular functions including calorie restriction, life span and metabolic stress. Sirtuin 3 (SIRT3) is localized in the mitochondrial matrix, where it regulates the acetylation levels of metabolic enzymes and antioxidant protection. In order to demonstrate the role of SIRT3 against drug-induced toxicity, we used a golden-standard agent to induce cardiotoxicity. Doxorubicin (DOX) is a widely used anti-cancer agent known for its dose-dependent and cumulative cardiotoxicity. The second specific aim in this thesis aimed to understand if DOX-induced toxicity is regulated by SIRT3 expression levels. We used a cardiomyoblast cell line, H9c2, to study SIRT3 under different expression levels. Interestingly, H9c2 cells have minimal levels of detectable SIRT3 mRNA, hence we used a transfection system to over-express this sirtuin. Cell mass, intracellular ATP levels, cell death and caspase 3/7 activities were evaluated in untreated and DOX-treated human SIRT3 (hSIRT3)-overexpressing cells, hSIRT3-H248Y-HA (mutant enzymatic form of hSIRT3) overexpressing cells and pcDNA control H9c2 cells. The results showed that hSIRT3 overexpression protected H9c2 cells from DOX-induced cell death and caspase-like activity, when compared with control cells, after 24h of DOX treatment. Surprisingly, hSIRT3-H248Y-HA overexpression also protected cells against DOX-induced cell death and caspase activity, but it decreased the ATP levels when compared to the control cells treated with DOX. free, galactose-containing media. Our results demonstrated strain-dependent differences in the response to some of the tested drugs. We propose that this model is a useful starting point to study compounds that may cause mitochondrial off-target toxicity in early stages of drug development, thus decreasing the number of experimental animals used. For the second specific aim, we investigated the role of mitochondrial sirtuins on drug-induced toxicity. Mammalian sirtuins are a family of seven protein deacetylases involved in many different cellular functions including calorie restriction, life span and metabolic stress. Sirtuin 3 (SIRT3) is localized in the mitochondrial matrix, where it regulates the acetylation levels of metabolic enzymes and antioxidant protection. In order to demonstrate the role of SIRT3 against drug-induced toxicity, we used a golden-standard agent to induce cardiotoxicity. Doxorubicin (DOX) is a widely used anti-cancer agent known for its dose-dependent and cumulative cardiotoxicity. The second specific aim in this thesis aimed to understand if DOX-induced toxicity is regulated by SIRT3 expression levels. We used a cardiomyoblast cell line, H9c2, to study SIRT3 under different expression levels. Interestingly, H9c2 cells have minimal levels of detectable SIRT3 mRNA, hence we used a transfection system to over-express this sirtuin. Cell mass, intracellular ATP levels, cell death and caspase 3/7 activities were evaluated in untreated and DOX-treated human SIRT3 (hSIRT3)-overexpressing cells, hSIRT3-H248Y-HA (mutant enzymatic form of hSIRT3) overexpressing cells and pcDNA control H9c2 cells. The results showed that hSIRT3 overexpression protected H9c2 cells from DOX-induced cell death and caspase-like activity, when compared with control cells, after 24h of DOX treatment. Surprisingly, hSIRT3-H248Y-HA overexpression also protected cells against DOX-induced cell death and caspase activity, but it decreased the ATP levels when compared to the control cells treated with DOX.

As mitocôndrias não são somente as fornalhas das células, como também os alvos principais de vários compostos tóxicos. As variações no DNA mitocondrial (mtDNA), incluindo as alterações singulares de nucleotídeos (SNPs) têm sido propostas como estando envolvidas nas reações idiossincráticas a fármacos (IDRs). Embora sendo um fenómeno raro, as IDRs são complicações sérias e por vezes, até fatais. Por isso, as IDRs são o maior desafio das empresas farmacêuticas que se deparam com fármacos de elevado valor económico a serem retirados do mercado. Os modelos in vitro e in vivo que existem atualmente, não são adequados para avaliar a toxicidade idiossincrática mitocondrial induzida por fármacos e não têm em conta a diversidade genética observada na população humana. O objetivo desta tese foi identificar novos aspetos intrínsecos, dependentes do hospedeiro, relativos à fisiologia mitocondrial, que possam contribuir para as IDRs. Estas duas propriedades intrínsecas são os SNPs no mtDNA mitocondrial e a quantidade/expressão das sirtuínas mitocondriais. O primeiro objetivo específico foi identificar se diferentes linhagens celulares com diferentes SNPs no mtDNA tinham diferenças na bioenergética mitocondrial e na resistência à toxicidade induzida por fármacos. Um sistema in vitro composto por quatro linhagens celulares de fibroblastos embrionários de ratinho (MEFs), que continham SNPs no mtDNA foram usados com este objetivo específico. Sequenciámos o mtDNA dos fibroblastos embrionários isolados de quatro estirpes diferentes de ratinho, C57BL/6J, MOLF/EiJ, CZECHII/EiJ e PERA/EiJ, sendo os dois últimos sequenciados pela primeira vez. O perfil bioenergético das quatro linhagens celulares de MEFs foi investigado para as passagens 3 e 10, de forma a compreender também o efeito do envelhecimento celular em cultura. Os nossos resultados demonstraram diferenças evidentes entre as quatro linhagens celulares de MEFs em ambas as passagens, tendo as CZECHII/EiJ um menor desempenho a nível mitocondrial quando comparadas com as C57BL/6J, seguidas das MOLF/EiJ e PERA/EiJ. O segundo objetivo específico foi testar no nosso modelo in vitro sete fármacos conhecidos por danificarem a função mitocondrial, através dos seus efeitos no conteúdo celular de ATP, em culturas que continham meios com glucose e sem glucose, mas contendo galactose. Os nossos resultados demonstraram diferenças dependentes de cada linhagem celular na resposta a vários fármacos. Propomos que este modelo seja um ponto de partida para a avaliação de compostos que causam disfunção mitocondrial não direcionada, em fases precoces do desenvolvimento de fármacos, diminuindo desta forma, o número de animais usados nas experiências. No segundo objetivo específico, investigámos o papel das sirtuínas mitocondriais na toxicidade induzida por fármacos. As sirtuínas dos mamíferos são uma família de sete proteínas desacetilases, envolvidas em diferentes funções celulares, nomeadamente na restrição calórica, longevidade e stresse metabólico. A sirtuína 3 (SIRT3) está localizada na matriz mitocondrial, onde regula os níveis de acetilação de enzimas metabólicas e a proteção antioxidante. De forma a demonstrar o papel da SIRT3 contra a toxicidade induzida por fármacos, usámos um composto chave de cardiotoxicidade. A doxorubicina (DOX) é um composto vastamente usado como agente anti-cancerígeno, conhecido pela sua cardiotoxicidade cumulativa e dependente da dose. O segundo objetivo específico desta tese foi entender se a toxicidade induzida pela DOX é regulada pelos níveis de expressão da SIRT3. Usámos uma linha celular de cardiomioblastos, as H9c2, para estudar a SIRT3 sob diferentes níveis de expressão. Curiosamente, as células H9c2 têm níveis de mRNA muito reduzidos de SIRT3, sendo que usámos um sistema de transfecção para sobrexpressar esta sirtuína. A massa celular, o conteúdo celular de ATP, a morte celular e a atividade de caspases 3/7 foram avaliadas em células tratadas com DOX e não tratadas que sobrexpressavam SIRT3 humana (hSIRT3); em células que sobrexpressavam a hSIRT3-H248Y-HA (forma enzimaticamente inactiva da hSIRT3) e em células H9c2 controlo pcDNA. Surpreendentemente, a sobrexpressão da hSIRT3-H248Y-HA também protegeu as células da morte celular e da atividade de caspases induzida pela DOX, mas diminui os níveis de ATP quando comparados com os das células controlo tratadas com DOX. O papel da mitocôndria nas IDRs foi estudado nesta tese. Chegámos à conclusão de que de é de facto muito provável que ambos os aspetos aqui investigados (os SNPs no mtDNA e o conteúdo de SIRT3) possam ter um impacto na resposta das mitocôndrias a fármacos. Uma vez que ambos são fatores dependentes do hospedeiro, antecipamos que possam ser uma componente, pelo menos em parte, das IDRs.