NMDA receptors-associated events and oxidative stress in models of Alzheimer's Disease

Abstract

Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder worldwide associated with severe memory loss. N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) activation has been recently implicated in AD-related synaptic dysfunction, when oligomeric amyloid beta (Aβ) peptide accumulation assumes a greater importance. However, little is known about the complex changes in NMDAR subunit composition and activation in AD. In this thesis we propose to evaluate the importance of NMDARs in AD progression using Ab 1-42 treated neuronal cultures, hippocampal and cortical brain samples from the 3xTg-AD mice, two brain areas involved in memory processes, and to investigate possible biomarkers of pathological progression linked to oxidative stress using peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) derived from AD patients. To accomplish these objectives, our work has been divided in three parts, described below. We first evaluated the role of NMDARs on Aβ-evoked neuronal dysfunction and cell death through changes in microtubule polymerization in mature hippocampal cultures (Chapter 3). Then, we analyzed age-and gender-dependent changes in NMDAR subunit (GluN1, GluN2A, GluN2B) protein levels and activation using cortical and hippocampal homogenates from the 3xTg-AD versus age-matched wild-type (WT) mice (Chapter 4). Moreover, because oxidative stress and deregulation of intracellular calcium (Ca2+ i) homeostasis are believed to be implicated in mechanisms upstream of AD-associated neuronal loss, in the third part of this work we studied markers of peripheral cell injury related with oxidative stress using PBMCs isolated from mild, moderate and severe AD patients and individuals with mild cognitive impairment (MCI) versus non-demented age-matched control subjects (Chapter 5). In this thesis, we showed that exposure of mature hippocampal cells to Aβ 1-42-enriched oligomer preparation caused a decrease in total and polymerized levels of beta-III tubulin, and polymerized alpha-tubulin, suggesting microtubule disassembly. Furthermore, effects of Aβ on neuronal tubulin polymerization were highly correlated with reduced neurite length and neuronal DNA fragmentation, a feature of cell death by apoptosis. Importantly, the protection provided by MK-801 and memantine suggested the involvement of extrasynaptic NMDARs, in particular GluN2B subunit-containing NMDARs, on Aβ toxicity. Analysis of total levels of NMDAR subunits in the cortex and the hippocampus of 3xTg-AD males and females evidenced unchanged levels of NMDAR subunits, namely GluN1, GluN2A and GluN2B. A similar result was obtained regarding the levels of post-synaptic density (PSD)-95, a protein responsible for the attachment of NMDARs to the membrane and the cytoskeleton. Similarly, no major changes regarding GluN2A Ser1232 phosphorylation or GluN2B Tyr1472 were observed in the cortex. Moreover, in the hippocampus of 3xTg-AD mice, females or males, no age-dependent changes were detected regarding GluN2A Ser1232 phosphorylation. Nevertheless, GluN2B Tyr1472 phosphorylation decreased in 3xTg-AD males at 3 months of age, and increased in 3xTg-AD females at 15 months of age, revealing gender differences in the activation of the GluN2B subunit during AD. Moreover, early alterations of GluN2B phosphorylation status in hippocampus correlated with the activity of the Src Tyr kinase. Interestingly, early decrease Src activation in both hippocampus and cortex of 3xTg-AD males also correlated with decrease in total and activated levels of Dab1, a target of Src implicated in cytoskeleton stabilization. Furthermore, we observed decreased levels of total cortactin, another target of Src and a protein involved in cytoskeleton stability. Thus, our data suggest weakened actin cytoskeleton stabilization (which should be tested in future studies) in young 3xTg-AD mice males exhibiting intracellular Aβ labeling, which was accompanied by a decrease in activated GluN2Bcomposed NMDARs in the hippocampus. In the third part of this work, we observed deregulation of Ca2+ i homeostasis in PBMCs from MCI subjects and mild AD patients. These alterations occurred concomitantly with increased reactive oxygen species (ROS) production levels in MCI PBMCs but were unrelated with changes in pro- or anti-apoptotic proteins. Concordantly, we demonstrated the downregulation of nuclear factor erythroid derived 2-related (Nrf2), a ROS-related transcription factor, which regulates the expression of several important antioxidants. Indeed, we observed decreased levels of superoxide dismutase (SOD)1, one of the Nrf2 target genes, in MCI’s PBMCs. In conclusion, our data suggest that Aβ-induced hippocampal neuronal dysfunction occurs through NMDAR-dependent microtubule disassembly associated to neurite retraction and DNA fragmentation in mature hippocampal cells. Moreover, results in 3xTg-AD evidenced age- and gender-dependent changes in GluN2B subunit activation and early decreased GluN2B activation in males, which was accompanied by decreased levels and activation of protein involved in cytoskeleton stabilization in early stages of AD. Indeed, we demonstrate an early involvement of NMDARs in disease progression and more particularly of the GluN2B subunit. Results obtained in PBMCs from preclinical and mild AD evidenced changes in Ca2+ i and redox homeostasis that correlate with decreased Nrf2. These data suggest that alterations observed in human peripheral blood cells during pre-clinical and initial stages of the disease might reflect brain changes and can thus be used to elucidate about the early molecular basis of cell dysfunction in AD. Indeed, we show that molecular changes related with oxidative stress may be detected at MCI, long before the first symptoms of the disease.

A doença de Alzheimer (DA) é a doença neurodegenerativa mais comum a nível mundial, apresentando-se associada a uma severa perda de memória. Alterações na ativação dos recetores do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA) têm sido implicadas na disfunção sináptica que ocorre na DA, em condições em que a acumulação do peptídeo beta amilóide (Aβ) assume uma maior importância. No entanto, a alteração na composição e ativação dos receptores NMDA que ocorre na DA ainda é pouco conhecida. Neste trabalho, propusemo-nos avaliar a importância dos recetores NMDA na progressão da doença, usando culturas neuronais tratadas com Aβ 1-42 e amostras de hipocampo e córtex de murganhos 3xTg-AD, duas regiões cerebrais envolvidas nos processos de memória. Propusemo-nos também investigar possíveis biomarcadores relacionados com o stresse oxidativo associados à progressão da doença, usando células mononucleares de sangue periférico (CMSPs) derivadas de doentes de Alzheimer. Para tal, o nosso trabalho dividiu-se em três partes, descritas seguidamente. Numa primeira parte avaliámos o papel dos receptores NMDA na disfunção e morte neuronal induzidas por Aβ e as alterações da polimerização dos microtúbulos em culturas maduras de hipocampo (Capítulo 3). Analisámos de seguida a dependência do sexo e da idade nos níveis de expressão proteica e ativação das subunidades GluN1, GluN2A e GluN2B dos recetores NMDA em homogeneizados de córtex e hipocampo de murganhos transgénicos 3xTg-AD versus murganhos “wild type” (WT) (Capítulo 4). Para além disso, tendo em conta o envolvimento do stresse oxidativo e da desregulação da homeostasia do cálcio intracelular (Ca2+ i) em mecanismos que precedem a morte neuronal associada à DA, na terceira parte do nosso trabalho avaliámos marcadores de lesão celular relacionados com o stresse oxidativo usando CMSPs isoladas de doentes com DA ligeira, moderada e severa e indivíduos com défice cognitivo ligeiro (DCL) versus indivíduos controlo com idades comparáveis e que não apresentavam disfunção cognitiva (Capítulo 5). Assim, demonstrámos que a exposição de células de hipocampo a uma preparação de Aβ 1-42 enriquecida em oligómeros causa a diminuição dos níveis de beta-III tubulina total e polimerizada, e dos níveis de alfa-tubulina polimerizada, sugerindo uma desorganização dos microtúbulos. Para além disso, os efeitos do Aβ na polimerização da tubulina neuronal mostraram estar correlacionados com uma redução do comprimento das neurites e com a fragmentação do ADN, demonstrando a ocorrência de morte celular por apoptose causada por Aβ. Curiosamente, a proteção promovida pelo MK-801 e pela memantina sugere o envolvimento de receptores NMDA extrasináticos, em particular os recetores contendo a subunidade GluN2B, na toxicidade induzida por Aβ. A análise dos níveis totais das subunidades dos recetores NMDA no córtex e no hipocampo de murganhos 3xTg-AD machos e fêmeas demonstrou que os níveis das subunidades GluN1, GluN2A e GluN2B dos recetores do NMDA não alteram com a idade ou com o sexo. Um resultado similar foi obtido para a proteína PSD-95 (do inglês “post-synaptic density-95”), responsável pela ancoragem dos recetores NMDA à membrana e ao citosqueleto. Da mesma forma, no córtex, não observámos alterações dos níveis de fosforilação das subunidades GluN2A ou GluN2B nos resíduos Ser1232 e Tyr1472, respetivamente. Além disso, no hipocampo dos murganhos 3xTg-AD machos e fêmeas, não encontrámos alterações na fosforilação da Ser1232 da subunidade GluN2A. No entanto, a fosforilação no resíduo Tyr1472 da subunidade GluN2B diminui no hipocampo de3xTg-AD machos jovens, com 3 meses de idade, e aumenta no hipocampo de fêmeas 3xTg-AD com 15 meses de idade, revelando diferenças dependentes do sexo na ativação da subunidade GluN2B na DA. As alterações precoces na fosforilação da subunidade GluN2B no hipocampo correlacionam-se com a atividade da Src. Curiosamente, o decréscimo da atividade da Src no hipocampo e no córtex aos 3 meses dos 3xTg-AD machos também se correlaciona com um decréscimo dos níveis totais e fosforilados da proteína Dab1, um alvo da Src implicado na estabilização do citosqueleto. Além disso, observámos uma diminuição dos níveis totais da cortactina, outro alvo da Src, também envolvida na estabilização do citosqueleto. Assim, os resultados obtidos no hipocampo sugerem uma destabilização do citosqueleto (que deverá ser testada em estudos futuros) em jovens machos 3xTg-AD que mostram uma marcação para Aβ intracelular, acompanhado de uma diminuição da ativação dos receptores NMDA contendo a subunidade GluN2B. Na terceira parte desta tese observámos uma desregulação da homeostasia do Ca2+ i nas CMSPs de doentes com DCL e DA ligeira. Estas alterações ocorrem de forma concomitante com um aumento dos níveis de espécies reactivas de oxigénio em CMSPs de doentes com DCL mas não estão relacionadas com alterações dos níveis de proteínas pró- ou anti-apoptóticas. De forma concordante, demonstrámos uma diminuição dos níveis de Nrf2 (do inglês “nuclear factor erythroid derived 2-related”), um fator de transcrição que regula a expressão de antioxidantes importantes. De facto, observámos uma diminuição dos níveis de superóxido dismutase 1 (SOD1), um dos genes alvo do Nrf2, em CMSPs de doentes com DCL. Em conclusão, os nossos dados sugerem que a disfunção neuronal induzida por Aβ em células maduras de hipocampo deve-se, em parte, à desregulação da rede de microtúbulos associada a uma retração das neurites e à fragmentação do ADN por um mecanismo dependente dos recetores NMDARs. Além disso, utilizando murganhos 3xTg-AD, os nossos resultados evidenciaram alterações da ativação da subunidade GluN2B dependentes do sexo e da idade, e um decréscimo da ativação da subunidade GluN2B associada a um decréscimo dos níveis e atividade de proteínas envolvidas na regulação da estabilidade do citosqueleto em machos 3xTg-AD jovens, correspondente a fases iniciais da DA. Assim, demonstrámos um envolvimento precoce dos recetores do NMDA na progressão da doença e mais particularmente da subunidade GluN2B. Os resultados obtidos em CMSPs de doentes com DCL e AD ligeira evidenciaram a ocorrência de modificações na homeostasia do Ca2+ i e da capacidade redox, que se correlacionam com uma diminuição do factor de transcrição Nrf2. Estes dados sugerem que as alterações observadas em células humanas de sangue periférico durante a fase pre-clínica e as fases iniciais da DA podem refletir as alterações observadas no cérebro dos doentes e serem utilizadas para investigar os mecanismos básicos de disfunção celular na DA. De facto, mostramos neste trabalho que as alterações moleculares relacionadas com o stresse oxidativo podem ser detetadas muito antes do aparecimento dos primeiros sintomas, nos indivíduos com DCL.