Gene/Protein Expression Profiles of Bone Marrow Mast Cells in Systemic Mastocytosis and their Association with the Subtype of the Disease

Abstract

Systemic mastocytosis (SM) comprises a heterogeneous group of disorders characterized by an abnormal accumulation of clonal mast cells in one or more organ systems. As a result of the clinicopathological heterogeneity of the disease, the World Health Organization currently defines several variants of the disease, including forms with a mild (e.g. indolent systemic mastocytosis – ISM) and subtypes with an aggressive behavior (e.g. aggressive systemic mastocytosis – ASM – and mast cell leukemia – MCL) which show a distinct prognosis and different therapeutic requirements. Despite this clinical heterogeneity, in the great majority of SM patients (>90%), except well‐differentiated SM (WDSM), the clonal nature of mast cells is demonstrated by the presence of the D816V activating mutation of KIT. Therefore the presence of this mutation per se does not account for the clinical, histopathological and prognostic variability observed among the distinct subtypes of SM, the molecular and biological basis underlying this heterogeneous behavior remaining largely elusive. In order to address this issue, in the present work we analyzed the protein and gene expression profiles of bone marrow (BM) mast cells from patients with distinct variants of SM, using multiparameter flow cytometry (MFC) and cDNA‐oligonucleotide microarrays, in order to gain insight into the biological mechanisms that contribute to explain the heterogeneity of the disease. In the first part of the work, we evaluated the expression profile of a broad set of proteins in BM mast cells from 123 patients diagnosed with distinct subtypes of SM. Overall, we detected three different maturation‐related protein expression profiles (PEP), associated with either the molecular and the prognostic subtypes of the disease. Accordingly, more immature features were detected in the aggressive forms of the disease (ASM and MCL), whereas indolent variants displayed a mature resting (WDSM) or activated (ISM with – ISMs+ ‐ and without skin lesions ‐ ISMs‐) immunophenotype, depending on the absence vs. the presence of the D816V activating mutation of KIT. Interestingly, the distinct PEP observed between ISM and ASM/MCL patients carrying the same D816V KIT mutation seem to be related with the degree of involvement of hematopoiesis by the KIT mutation; ASM/MCL patients typically showed multilineage BM involvement in contrast to ISM patients, in whom this mutation was typically restricted to the mast cell compartment. Altogether, these results suggest that the occurrence of an extended clonal hematopoiesis could be associated with an earlier blockade of mast cell maturation among patients with more aggressive forms of the disease. Recently, it has been described that around 20% of ISMs+ cases also show multilineage BM involvement by the KIT mutation, a disease feature which has been reported to be the most powerful independent prognostic factor for progression of ISMs+ to more aggressive disease (e.g. acute myeloid leukemia, myelodysplastic syndrome or ASM). Based on this knowledge, we hypothesized that an association could exist between the PEP of BM mast cells from ISMs+ patients and the degree of involvement of hematopoiesis by the KIT D816V mutation. Unsupervised and supervised analysis strategies, performed on distinct groups of patients, confirmed this hypothesis. Accordingly, mast cells from patients with multilineage BM involvement by the D816V KIT mutation exhibited more immature features, whereas those cases with the KIT mutation restricted to BM mast cells showed a mature activated immunophenotypic profile, regardless of the diagnostic subtype of the disease. Since detection of multilineage KIT mutation currently requires a set of techniques which are not easily available in most routine diagnostic laboratories, we further investigated the potential utility of the assessment of the PEP of BM mast cells from ISM patients, as a surrogate marker for the diagnostic screening of multilineage involvement of hematopoiesis by the KIT mutation. For this purpose, we developed a score‐based class prediction algorithm for the detection of these later cases. Therefore, such cases were efficiently identified by the presence of an increased BM mast cell burden associated with aberrant expression of CD25 and an immature FcεRIlo, CD45lo, FSClo and SSClo phenotype, in the absence of coexisting normal mast cells in the BM. This algorithm exhibited a high efficiency both in a training group of SM patients and in two additional validation sets of patients, regardless of the diagnostic subtype of the disease; moreover, it also showed a significant impact on the progression‐free survival of ISMs+ patients, similar to that of the currently used molecular techniques. Altogether, these results suggest that the immunophenotype of BM mast cells could be used as a surrogate marker for multilineage involvement of BM hematopoiesis by the KIT mutation, for prognostic stratification of ISMs+ patients. In the last part of our work we analyzed the gene expression profile (GEP) of highly‐ purified BM mast cells from SM patients carrying the D816V KIT mutation classified according to the diagnostic subtype of SM vs. those of normal/reactive BM mast cells. Overall, our results showed that the presence of the D816V KIT mutation is associated with a common GEP, which was mainly characterized by up‐regulation of genes involved in innate and inflammatory immune responses, including interferon‐induced genes involved in the response to viral infections and complement inhibitory molecules. Most interestingly, a distinct GEP was also found among the different subtypes of SM, reflecting an increased lipid metabolism in ISMs‐ vs. increased transcription and protein processing in ISMs+, and deregulation of apoptosis and cell cycle in ASM. In conclusion, our results show that the clinical and prognostic heterogeneity underlying the distinct variants of SM is associated with distinct protein and gene expression profiles of BM mast cells from these groups of patients, highlighting the potential nature of relevant secondary genetic lesions and/or microenvironmental alterations which may be common to patients classified together in the distinct diagnostic subgroups of SM.

O termo mastocitose sistémica (MS) abrange um conjunto heterogéneo de doenças caracterizadas por uma acumulação anómala de mastócitos clonais num ou mais órgãos ou tecidos. Como consequência da heterogeneidade clínico‐patológica da doença, atualmente a Organização Mundial da Saúde (OMS) define várias variantes de MS, incluindo formas com um comportamento indolente (p. ex: MS indolente – MSI) e outras com caráter mais agressivo (p. ex: MS agressiva – MSA – ou leucemia de mastócito – LM), com distinto prognóstico e necessidades terapêuticas. Apesar desta heterogeneidade clínica, na maioria dos casos (>90%) e com a única exceção das MS bem diferenciadas (MSBD), a natureza clonal dos mastócitos é demonstrada pela presença da mutação ativante de KIT D816V. No entanto, esta mutação per se não explica a variabilidade observada a nível clínico, histopatológico e prognóstico entre os distintos subtipos diagnósticos da doença. Neste sentido, hoje em dia seguimos sem conhecer com precisão as bases moleculares e biológicas do comportamento heterogéneo da doença. No presente trabalho propusemo‐nos analisar os perfis de expressão proteica e génica dos mastócitos de medula óssea (MO) de doentes diagnosticados com distintas variantes de MS, aplicando técnicas de citometria de fluxo multiparamétrica (CFM) e microarrays de oligonucleótidos de cDNA, com o objectivo de compreender melhor a base biológica desta doença tão heterogénea. Na primeira parte do estudo, focámos o nosso interesse na avaliação do perfil de expressão de um conjunto amplo de proteínas em mastócitos de MO de 123 doentes com distintos subtipos de MS. De forma geral, observámos três perfis de expressão proteica (PEP) que refletiam o grau de diferenciação das células neoplásicas e que se associavam com o subtipo molecular e prognóstico da doença. De forma mais específica, as formas agressivas da doença (MSA e LM) apresentavam características fenotípicas de mastócito imaturo, em contraposição com as variantes indolentes, nas quais os mastócitos de MO apresentavam características fenotípicas de célula madura em repouso (MSBD) ou ativada (MSI com – MSIs+ ‐ e sem – MSIs‐ lesão cutânea), associadas à ausência ou à presença da mutação ativadora de KIT D816V, respectivamente. Curiosamente, as diferenças no PEP observadas entre os doentes com MSI e MSA/LM, que partilham a mesma mutação de KIT, parecem estar relacionadas com o grau de afetação clonal da hematopoiese nestes doentes; assim, em indivíduos diagnosticados com MSA/LM esta mutação é tipicamente encontrada em várias linhas celulares da MO, em claro contraste com as MSI, nas quais a mutação estava restringida aos mastócitos. Estes resultados sugerem que a ocorrência de uma hematopoiese clonal pode estar associada a um bloqueio precoce da maturação do mastócito nas formas mais agressivas da doença. Curiosamente, aproximadamente 20% dos doentes com MSIs+ também apresentam a mutação D816V de KIT noutras linhas celulares da MO, constituindo estes doentes um grupo de pior prognóstico, com elevado risco de progressão para formas da doença e para doenças mais agressivas (p. ex: leucemia mieloblástica aguda, síndrome mielodisplásico ou MSA). Tendo em conta o PEP mais imaturo previamente observado nas formas mais agressivas da doença, foi colocada a hipótese da possível existência de uma associação significativa entre o PEP dos mastócitos de MO de doentes com MSIs+ e o grau de afetação das diferentes linhas celulares da MO pela mutação D816V de KIT. Para testar esta hipótese usámos duas estratégias de análise diferentes (não supervisionada e supervisionada) em grupos distintos de doentes. Em ambos os casos, nos doentes que apresentavam a mutação de KIT em várias linhas celulares, os mastócitos mostravam características mais imaturas, por oposição aos casos em que a mutação estava restringida aos mastócitos, e que exibiam características de células maduras ativadas, independentemente do subgrupo diagnóstico. Considerando que a deteção da mutação de KIT nas distintas linhas celulares de MO atualmente requer a aplicação de um conjunto de técnicas que não estão facilmente disponíveis nos laboratórios de diagnóstico clínico de rotina, decidimos averiguar a utilidade do estudo do PEP de mastócitos de MO de doentes com MS, para a triagem diagnóstica de casos com afetação de várias linhas celulares hematopoiéticas pela mutação D816V de KIT. Para tal desenvolvemos um sistema de pontuação para a deteção dos referidos casos. Assim, estes eram facilmente identificados pela co‐existência de um aumento da carga mastocitária associada à expressão aberrante de CD25 em células com características imaturas (FcεRIlo, CD45lo, FSClo, SSClo), na ausência de uma população de mastócitos normais na MO. Este sistema de pontuação mostrou uma alta eficiência na classificação tanto de um grupo de doentes de training como de outros dois grupos adicionais de doentes de validação, independentemente do subtipo diagnóstico de MS. Para além disso o citado sistema de pontuação mostrou também um impacto significativo na sobrevida livre de progressão dos doentes, idêntico ao obtido com a deteção do envolvimento de várias linhas celulares pela mutação D816V de KIT, usando técnicas moleculares. Estes resultados sugerem que a avaliação do PEP de mastócitos de MO poderia ser usada para a estratificação prognóstica de doentes com MSIs+. Na última parte do trabalho, estudámos os perfis de expressão génica (PEG) de mastócitos purificados de MO de doentes com diferentes subtipos de MS portadores da mutação D816V de KIT, classificados de acordo com o subgrupo diagnóstico da doença. Os resultados obtidos mostraram que a presença da mutação D816V de KIT se associa a um PEG comum, caracterizado principalmente pelo incremento de expressão de genes envolvidos na resposta imune inata e inflamatória, incluindo genes induzidos por interferão implicados na resposta a infeções virais, bem como moléculas inibidoras do complemento. Por outro lado, observaram‐se diferentes PEG associados às distintas variantes da doença estudadas; estes perfis específicos refletiam um aumento no metabolismo lipídico nas MSIs‐ vs. um incremento a nível da transcrição e processamento de proteínas em MSIs+, e uma alteração da apoptose e do ciclo celular nas MSA. Em conclusão, os nossos resultados mostram que a heterogeneidade clínica e prognóstica observada nas distintas variantes de MS está associada a perfis de expressão génica e proteica diferentes nos mastócitos da MO destes doentes, evidenciando a possibilidade da coexistência de lesões genéticas e/ou alterações no microambiente medular adicionais, e potencialmente diferentes, nos distintos subtipos diagnóstico da doença.